نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشکدة علوم‌زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشکدة علوم‌زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
3 دانشجوی دکتری، گروه بیوتکنولوژی، دانشکدة علوم‌زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
4 کارشناسی‌ارشد، گروه بیوتکنولوژی، دانشکدة علوم‌زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران
چکیده
اهداف: سیکلوتیدها خانوادة بزرگی از پپتیدهای گیاهی با فعالیت زیستی و ویژگی‌های ساختاری متمایز است که در خانواده‌های گیاهی روبیاسه‌ها، کوکوربیتاسه‌ها و ویولاسه‌ها بیان می‌شود. سیکلوتیدها به‌دلیل فعالیت‌های زیستی متعدد از جمله ضدویروس، ضدباکتری و ضدسرطان، همچنین ساختار منحصربه‌فردی که پایداری حرارتی و آنزیمی بی‌نظیری به آن بخشیده است، انتخابی مناسبی برای مهندسی پروتئین در کاربردهای دارویی و کشاورزی است.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش، استخراج ژن‌های کدکنندة سیکلوتیدها از چهار نمونه گیاه بنفشة V. odorata، V. occulta، V. ignobilis، V. spathulata انجام شد. به‌منظور شناسایی ژنسیکلوتید، طراحی پرایمر و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز صورت گرفت. همچنین، آثار ضدمیکروبی مجموعة سیکلوتیدها بررسی شد. برای رسیدن به این هدف از روش جزءگیری و استخراج با فاز جامد استفاده شد.
یافته‌ها: حضور ژن‌های سیکلوتید در گونه‌های مورد مطالعه به اثبات رسید. بررسی آثار ضدمیکروبی سیکلوتیدها نشان داد که از میان باکتری‌های بیماری‌زای انسانی استافیلوکوکس اورئوس بیشترین حساسیت را به پپتیدهای مورد مطالعه دارد و در بین مجموعة باکتری‌ها بیشترین حساسیت مربوط به سویة زانتوموناس اوریزوآ است، چرا که نقش ذاتی سیکلوتیدها در گیاه میزبان دفاع در مقابل آفات است.
نتیجه‌گیری: به طور کلی، به‌نظر می‌رسد که احتمالاً می‌توان از پپتید سیکلوتید حاصل از این گونه‌های بنفشه به‌دلیل وجود اثر ضدمیکروبی در مصارف دارویی استفاده کرد. همچنین، مطالعة توالی سیکلوتیدها نشان می‌دهد، علی‌رغم وجود اسید آمینه‌های حفاظت‌شده در اکثر سیکلوتیدها، تفاوت عملکرد در آن‌ها به‌دلیل تنوع توالی است.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The identification of gene coding cyclotide from viola species and investigation of antimicrobial activities of extracted cyclotides
نویسندگان [English]
- Mahboube Zarabi 1
- Akram Roshan 2
- Ezat Asgarani 3
- Mona Pakdel 4
- Mahsa Rouini 2
1 Alzahra university
2 Alzahra University
3 Alzahra University
4 Alzahra University
چکیده [English]
Background and aim:Cyclotides are plant polypeptides characterized by their unique cyclic cysteine knot structural motif. They are present in many plants from the Violaceae, Rubiaceae and Cucurbitaceae families. But they also have variety of biological activities, including anti-HIV, antimicrobial and cytotoxic activities. Because of their exceptional stability, they have attracted interest as a potential starting point material for protein engineering and drug design.
Materials and Methods: The aim of this study is identification of genes encoding cyclotides from V. odorata, V. occulta, and V. ignobilis. We also study antimicrobial effect of cyclotides extracted from V. ignobilis. To reach this aim extraction of cyclotide was done by fractionation and solid phase extraction methods.
Results: Findings indicate the presence of the cyclotide gene in all three plant species which studied. Examination of antimicrobial effect of partial purified cyclotide, defined S. aureus is the most susceptible bacterium among human pathogenic and X. oryzea is the most susceptible bacterium among all of studied bacteria.
Conclusion: In general, it seems that it can be used cyclotide peptide in most of the viola species because of their anti-peptide property in the pharmaceutical industry. Study of cyclotide sequences shows that despite of existence of conserved amino acids in the most of cyclotides, the differences in performance are due to sequence variation.
کلیدواژه‌ها [English]
- Antimicrobial
- cyclotides
- viola
مقدمه
پپتیدهای حلقوی در همة موجودات وجود دارد و غالباً دارای ساختار حلقوی سر- دم و یک یا چند پیوند دی‌سولفید است. به‌دلیل پایداری منحصربه‌فرد خود در برابر عوامل شیمیایی، حرارتی و بیولوژیکی، انتخاب مناسبی برای طراحی داروست [1]. سیکلوتیدها پپتیدهای حلقوی گیاهی با طول 28-37 آمینو اسید و دارای سه پیوند دی‌سولفید با آرایش سیستین نوت است [2]. تاکنون 22 جنس و 900 گونه از خانوادة ویولاسه‌ها شناسایی‌شده است که عمدتاً در مناطق معتدله متمرکزند. همة گونه‌های بررسی‌شدة خانوادة بنفشه حاوی سیکلوتید است [3]. نمونة اصلی سیکلوتیدی kalataB1 است که نخست در برگ‌های گیاه آفریقایی affinisOldenlandia کشف شد [4]. فعالیت ذاتی سیکلوتید در میزبان گیاهی، دفاع در مقابل آفات و پاتوژن‌هاست. برخی فعالیت‌های زیستی سیکلوتید شامل ضدمیکروب [5]، anti-HIV [6]، ضدسرطان [7] و حشره‌کش [8] است.
در تحقیق تام و همکاران چهار سیکلوتید کاملاً به روش شیمیایی سنتز و فعالیت آن علیه باکتری‌های مختلف (چهار گرم- منفی و دو گرم- مثبت) با استفاده از سنجش انتشار شعاعی (RAD) بررسی شد. سیکلوتیدهای سنتزی شامل kalataB1 است که علیه باکتری‌های گرم- مثبت مثل اورئوس در غلظت‌های زیر میکرومولار فعال است؛ ولی علیه باکتری‌های گرم- منفی نسبتاً غیرفعال است. سازوکار اثر آن از سازوکار تخریب‌کنندة غشا تبعیت می‌کند؛ اما سازوکار دقیق عملکرد و ارتباط میان ساختار و توانایی بالقوة آن هنوز به‌خوبی شناخته نشده است [9]. با استفاده از این نتایج و بررسی سیکلوتیدهای سنتزی و فولدینگ اکسایشی سیکلوتیدها، چنین برمی‌آید که ساختار منحصربه‌فرد سیکلوتیدها نقطة قوتی برای طراحی آنتی‌بیوتیک‌های پپتیدی است [10].
مطالعات نشان داده‌اند که ساختار سیکلوتیدها در مقابل جهش‌ها انعطاف‌پذیر است. این امر قابلیت کاربرد دارویی آن را افزایش می‌دهد. سیکلوتیدها موتیف گره سیستینی (cystine knot) ساخته‌شده از سه پیوند دی‌سولفید حفاظت‌شده را شامل می‌شود. دو پیوند از این پیوندهای دی‌سولفیدی و بخش‌های ساختمان اصلی متصل‌کنندة آن حلقه‌ای را تشکیل می‌دهد که در ساختار پپتید جاسازی شده است و با باند دی‌سولفیدی سوم احاطه می‌شود. ساختار گره سیستئین حلقوی (CCK) سبب مقاومت و پایداری منحصربه‌فرد سیکلوتیدها به حرارت، مواد شیمیایی و آنزیم‌ها شده است [11]. بعضی گیاهان تولیدکنندة سیکلوتید به‌صورت طبیعی، برخی سیکلوتیدها را با بازده تا 2 گرم از سیکلوتید به ازای هر کیلوگرم از بافت گیاهی، بسیار کارآمد می‌سازد و اگر این را بتوان به تولید سیکلوتیدهای دارویی تغییریافته در گیاهان تراریخت مبدل کرد، احتمالاً مقرون‌به‌صرفه‌ترین راه تولید سیکلوتیدها خواهد بود. سلول‌های گیاهی کشت داده‌شدة O. affinis نیز برای تولید سیکلوتیدهای طبیعی با بازده عالی استفاده می‌شود و روش‌های بیان با مداخلة اینتئین در بیان سیکلوتیدها در ای کولای، با بازده تا بیش از 5/0-1 میلی‌گرم بر لیتر از باکتری کشت داده‌شده توسعه یافته است [12].
هدف از این تحقیق استخراج ژن‌های کدکنندة سیکلوتیدها از چهار گونه بنفشه شامل V. spathulata، V. ignobilis، V. odorata و V. occulta و بررسی ویژگی ضدمیکروبی پپتیدی آن است.
مواد و روش‌ها
جمع‌آوری گیاه و استخراج DNA
گونه‌های گیاهی مورد استفاده در این پژوهش از نواحی استان‌های مازندران (Viola ignobilis, Viola odorata)، زنجان (Viola occulta) و ارتفاعات البرز (V. spathulata) در کشور ایران، در فصل بهار جمع‌آوری شد. گیاهان در مرکز تحقیقاتی دارو و گیاهان دارویی دانشگاه شهید بهشتی شناسایی شد (کد هر باریم PNSH-900280). DNA تام با استفاده از بافر C-TAB با پروتکل شرح‌داده‌شدة پیرتیلا و همکاران جدا شد [13]. سپس، کیفیت و غلظت DNA تخلیص‌شده با استفاده از اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز آگارز 8 درصد تعیین شد. پرایمرهای مورد استفاده در این واکنش بر اساس توالی‌های سیکلوتیدها طراحی شد که در Genbank موجود است. همچنین، از نرم‌افزار Genrunner در طراحی استفاده شده است (جدول 1).
طراحی پرایمر و واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز
برنامة واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به‌صورت زیر انجام شد: چرخة واسرشتی اولیه در °C 94 به مدت پنج دقیقه، سی سیکل واسرشت در یک دقیقه؛ در °C 94، اتصال در یک دقیقه؛ در °C 52-72(بر اساس پرایمر) گسترش در یک دقیقه؛ در °C 72، مرحلة بعد شامل چرخة گسترش نهایی در 20 دقیقه.
جدول 1. توالی و مشخصات پرایمرها در گونه‌های مورد مطالعه
|
نام گونه |
طول قطعه تکثیری |
Tm(ºC) |
توالی |
نام پرایمر |
|
V.ignobilis V. odorata V.occulta |
Bp150 |
5/52 6/52 |
ACCGTCATCTCAAATCC CGAGAGAGTTCCTGTAGC |
Vbc F Vbc R |
|
V. spathulata |
bp570 vsc-1 |
2/64 8/63 |
GACCTTTGAGAAAGATTTCATCAC AAGGAGACATCAAACCACGC |
Forward A Reverse A |
|
bp444 vsc-3 |
2/64 8/63 |
GACCTTTGAGAAAGATTTCATCAC GCAAACACACGAGCGGAG |
Forward B Reverse B |
|
|
bp479 vsc-1 |
65 6/63 |
AGTCTGCACCAGAAACTCTCTTG GGTAAATCCATATGTCACGAGC |
Forward C Reverse C |
محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با ژل الکتروفورز تخلیص‌شده پس از خالص‌سازی باندها به کمک کیت Qiagen، برای تعیین توالی به شرکت Bioneer فرستاده شد.
استخراج پپتید
به‌منظور حذف پلی‌پپتیدها، باقی‌ماندة خشک‌شدة گیاه با محلول اتانول 50 درصد آبی عصاره‌گیری شد. این عصاره در جریان هوا به مدت یک شب تغلیظ و با افزودن استیک اسید به میزان 2 درصد حجم نهایی عصاره اسیدی شد. با استفاده از ستون پلی‌آمید، پلی‌فنل‌های موجود در عصارة اتانولی حذف شد. سپس، با لیوفیلیزاسیون عصاره را به‌صورت پودر خشک درآوردیم. برای تکمیل مراحل خالص‌سازی 1 گرم از پودر به‌دست‌آمده در 100 سی‌سی آب مقطر حل و سه بار با 100 سی‌سی بوتانول عصاره‌گیری شد. در این مرحله، بعد از حذف حلال فاز بوتانولی مرحلة قبل، 25 میلی‌گرم از پودر به‌دست‌آمده در 8 میلی‌لیتر بافر استات آمونیم برای حذف ناخالصی‌ها حل شد. نمونه روی ستون سیلیکاژل C18 به‌ترتیب با محلول‌های 20، 50 و 80 درصد اتانول شست‌وشو داده شد (4 میلی‌لیتر از هر محلول). سپس، سنجش پروتئین با روش بردفورد صورت گرفت. همچنین، میزان خلوص نمونة پپتیدی با روش Tricin-PAGE تعیین شد.
بررسی آثار ضدمیکروبی سیکلوتیدها
به‌منظور بررسی آثار ضدمیکروبی سیکلوتیدها، نخست بافر فسفات سدیم تهیه شد. محیط‌های کشت به‌کاررفته شامل TSA و TSB و محیط‌های کشت A و B مورد استفاده در سنجش انتشار شعاعی است. محیط کشت A حاوی TSB، آگارز LE (Low Electro density)، و توئین 20 و محیط کشت B حاوی TSB، آگارز LE است که هر دو محیط با بافر فسفات سدیم به حجم مورد نظر رسید. به‌دلیل اینکه پلی‌پپتیدهای ضدمیکروبی سیکلوتیدها باردار است، برای کاهش میان‌کنش الکترواستاتیکی میان آن و اجزای سولفات رزیدوهای قند آگاروپکتین به‌جای آگار از مادة ژلاتینی آگارز LE استفاده شد [14].
به‌منظور سنجش فعالیت ضدمیکروبی مجموعة پلی‌پپتیدهای استخراج‌شده، روش انتشار شعاعی (RDA) استفاده شد [10]. نخست، هر یک از باکتری‌ها در محیط TSB رشد داده شد تا میزان OD آن‌ها در 600 نانومتر به 3/0 برسد. سپس، به میزان 1 میلی‌لیتر از محیط کشت در دمای °C 4 و به مدت ده دقیقه با سرعت g 3400 سانتریفوژ شد. سپس، رسوب سلول‌های باکتریایی یک‌بار با بافر فسفات سدیم سرد شسته شد. در نهایت در 1 میلی‌لیتر از همان بافر سوسپانسیون گشت. تعداد تقریبی CFU 104×4 از باکتری مورد نظر به 10 میلی‌لیتر از محیط کشت A اضافه شد. این مخلوط خوب به‌هم‌زده شد و در پتری دیشی به قطر 85 میلی‌متر اضافه شد به‌گونه‌ای که لایة یکنواختی ایجاد شود. بعد از بسته‌شدن محیط کشت در پلیت، چاهک‌هایی به قطر 3 میلی‌متر تعبیه و نمونه‌های پپتیدی به هر چاهک اضافه شد. پلیت‌ها در دمای ºC 37 به مدت سه ساعت انکوبه شد. در این مدت پپتیدها اجازة انتشار پیدا خواهد کرد. سپس، 10 میلی‌لیتر از محیط کشت B که دمای آن ºC 42 است به پلیت‌ها افزوده شد، به‌گونه‌ای که لایة یکنواختی ایجاد شود. بعد از 18-24 ساعت گرمخانه‌گذاری در ºC 37 قطر ناحیة شفاف با خط‌کش اندازه‌گیری شد. سویه‌های به‌کاررفته در تعیین آثار ضدمیکروبی در این پژوهش در جدول 2 ذکر شده است.
جدول 2. سویه‌های مورد استفاده در تعیین آثار ضدپپتیدی
|
سویه‌های بیمای‌زای انسانی |
Escherichia coli ATCC25922 |
|
Staphylococcus aureus PTCC1431 |
|
|
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 |
|
|
باکتری‌های بیماری‌زای گیاهان |
Xanthomonasoryzea |
|
باکتری‌های مفید خاک |
Rizobiumcicil |
|
Bacillus sp. |
سنجش انتشار شعاعی (RDA)
روش انتشار شعاعی به‌منظور بررسی قدرت ضدمیکروبی پپتیدهای استخراج‌شده استفاده شد. به‌طور خلاصه، در این روش باکتری‌ها در محیط TSB (Tripton Soy Broth) رشد کرد تا میزان جذب نوری آن در 600 نانومتر به 3/0 برسد. سپس، 1 میلی‌لیتر از محیط کشت در ºC 4 با سرعت g 3400 به‌مدت ده دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب حاصل یک‌بار با بافر فسفات سدیم SPB 01/0 میلی‌مولار و pH 8 شسته و سرانجام در SPB سرد سوسپانسیون شد. تقریباً 106×4 کلونی در لایة زیرین محیط کشت شامل W/v 03/0 درصد TSB، W/V 1 درصد آگارز LE و V/V 02/0 درصد Tween 20 جمع شد. مخلوط به پتری دیش اضافه شد (85 میلی‌لیتر). در نهایت، با استفاده از ژل 3 میلی‌متری دیوارهایی ساخته و 5 یا 10 میکرولیتر پپتید استخراج (غلظت 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر) یا کنترل 5 میکرولیتر DMSO 10 درصد به هر دیواره اضافه شد. مخلوط به مدت سه ساعت در دمای °C 37 به‌منظور انتشار پپتیدها در انکوباتور گذاشته شد. سپس، لایة بالایی کشت (W/V 6 درصد TSB، W/V 1 درصد آگارز در 10 میلی‌لیتر SPB) اضافه شد. پلیت‌ها یک‌شب در دمای °C 37 انکوبه شد.
یافته‌ها
توالی سیکلوتیدها
اطلاعات مربوط به کیفیت DNA استخراج‌شده با روش C-TAB در گونه‌های V.odorata، V. occulta، V. ignobilis و V. spathulataدر جدول 3 آمده است.
جدول 3. کیفیت DNA استخراج‌شده
|
نمونه |
غلظت DNA (ng/ml) |
280/260 |
230/260 |
|
V. ignobilis |
6/824 |
91/1 |
8/1 |
|
V. odorata |
200 |
9/1 |
8/1 |
|
V.occulta |
6/872 |
2 |
9/1 |
|
V. spathulata |
08/0 |
86/1 |
38/1 |
با استفاده از پرایمرهای mra باندی رؤیت نشد. بنابراین، ژن سیکلوتید در تمام گونه‌های موردبررسی مشاهده شد (جدول 4).
هم‌ترازی پپتیدهای حاصل از ترجمة ژن‌های استخراج‌شده در این پژوهش با توالی‌های پپتیدی موجود در پایگاه اطلاعاتی نشان داد که مشابه‌ترین سیکلوتید به‌دست‌آمده توالی vbc6 است (شباهت 94 درصد، 88 درصد، 89 درصد به‌ترتیب vbcO1، vbcL2 و vbcC3). توالی‌های پپتیدی پیشگویی‌شده نشان داد که vbc6 یا سیکلوتید 2d بیشترین شباهت را به‌ترتیب با vbcO1، vbcL2 و vbcC3 دارد. نتایج هم‌ترازی توالی به‌دست‌آمده با توالی‌های ثبت‌شده برای ژن vocC3 96 درصد شباهت را نشان می‌دهد.
نتایج حاکی از حضور ژن vbc در سه گونة V.odorata، V.occulta و V. ignobilis و ژن kalata در گونة V. ignobilis و ژن voc-C3 در V. spathulata است. از طرفی، با توجه به پرایمر طراحی‌شده برای ژن mra این ژن در گونه‌های مورد مطالعه دیده نشد (شکل 2).
جدول 4. توالی‌های پپتیدی حاصل از ترجمة ژن vbc استخراج‌شده در گونه‌های V. odorata، V. occulta، V. ignobilis، V. spathulata
|
توالی پپتیدی حاصل از ترجمة ژن vbc استخراج‌شده |
نام گونه |
|
TVISNPVLEEALLKNSHGVNGIPCGESCVWIPCISAAIGCSCKSKVCYRNSL |
V. odorat |
|
IPCGESCVRIPCITAAFGCSCNSKVCYRNSL |
V. occulta |
|
LLTQSGRYGIPCSESCVFIQCFTAAIGCSCNSKVCYRNSL |
V.ignobilis |
|
ESAPLSNLMLEEDVINALLKSKTVISNPIIEEALLKNSNGLNGIPCGESCVWIPCISAAIGCSCKNKVCYRNSLDN |
V. spathulata |
شکل 1. A) شناسایی ژن سیکلوتید در نمونة V. spathulataهمراه با شاخص وزن مولکولی bp 100+، B) شناسایی ژن سیکلوتید در سه نمونة V. ignobilis، V.odorataو V.occultaهمراه با شاخص وزن مولکولی bp 100+
شکل 2. A) تکثیر PCR از پرایمر vbcبرای DNA ژنومی. ردیف 1: vbco1از v. odorata. ردیف 2: vbc از v. ignobilis. ردیف 3: vbcC3 از V. occulta. B) تکثیر PCR از پرایمر kalata برای DNA ژنومی. ردیف 1: V. ignobilis. C) تکثیر PCR از پرایمر mra برای DNA ژنومی در هر سه گونه
بررسی وزن مولکولی سیکلوتید استخراج‌شده
طبق نتایج حاصل از پژوهش‌های انجام‌شده [15 و 16] بیشترین غلظت سیکلوتید در محلول اتانولی 50 درصد حاصل از شست‌وشوی ستون SPE وجود دارد. برای تأیید حضور سیکلوتید در این محلول از روش Tricine-SDS-PAGE استفاده شد. وزن مولکولی سیکلوتیدها بین 2800 تا 5000 دالتون است (شکل 3).
شکل 3. ستون 1. مارکر وزن مولکولی، ستون 2. محلول حاصل از شستشو با اتانول 50 درصد
سنجش RDA در باکتری‌های بیماری‌زای انسانی
مطالعات گذشته نشان می‌دهد که RDA روش مفیدی برای بررسی فعالیت ضدمیکروبی مواد مختلف است [17]. بنابراین، در این مطالعه نیز از این روش در ارزیابی فعالیت مجموعة سیکلوتیدهای نیمه‌خالص‌شده در محلول اتانول 20، 50 و 80 درصد استفاده شد. فعالیت در برابر باکتری‌های بیماری‌زای انسانی، باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی و باکتری مفید خاک و قطر مناطق شفاف در جدول 5 آمده است. اثر پپتیدهای استخراج‌شده در غلظت 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر مختلف بر باکتری‌های بیماری‌زا در شکل 4 نشان داده شده است. نتایج بیانگر این است که محلول اتانول 50 درصد بیشترین اثر ضدباکتری را در مجموعة مورد مطالعه دارد.
بحث
با توجه به ویژگی‌های منحصربه‌فرد سیکلوتیدها و قابلیت‌های درمانی آن، اخیراً [18] مطالعات گسترده‌ای در زمینة شناسایی ژن آن‌ها صورت گرفته است، چرا که با به‌دست آوردن ژن رمزکنندة سیکلوتید می‌توان آن را در میزبان مناسب تولید کرد. به‌تازگی، سیستم‌های بیانی گیاهان در باکتری‌ها برای تولید پپتیدهای حلقوی گسترش یافته است. نخستین مطالعات روی ژن‌های سیکلوتیدها را دوتان و همکاران روی گیاه O. affinisو V.odorataاز خانوادة Rubiaceae و ژانگ و همکاران روی گیاه Viola baoshanensis با استفاده از تکنیک RACE و RT-PCR انجام دادند [19 و 20]. مطالعات صورت‌گرفته در ایران روی ژن‌های سیکلوتید محدود به پژوهشی است که دلیر و همکاران روی V. odorata انجام دادند [15].
پژوهش حاضر، به‌منظور شناسایی ژن‌های سیکلوتید از برگ گیاهان بنفشه استفاده شد. لازم به یادآوری است پراکندگی دو گونة V. ignobilisو V. occultaمحدود به ایران و چند کشور همسایة شرقی ایران است. گونة V. spathulataنیز از نظر جغرافیایی منحصر به ایران است و تاکنون هیچ‌گونه مطالعه‌ای روی ژن‌های آن صورت نگرفته است. با استفاده از پرایمر طراحی‌شده از منطقة ترجمه‌نشده (NTR) و بخش انتهایی پپتید بالغ، برخی ژن‌های سیکلوتید در گونه‌های مورد مطالعه شناسایی شد. حفاظت‌شدگی منطقة NTR نقش حیاتی آن را در پیچ‌خوردگی و پردازش سیکلوتید نشان می‌دهد [19]. حضور ژن kalata در گونة V. ignobilis ژن vbc در سه گونة odorata، ignobilis، occulta و ژن voc3 در spathulata به اثبات رسید. همچنین، عدم حضور ژن mra در گونه‌های مورد مطالعه مشخص شد.
جدول 5. قطر هالة عدم رشد (میلی‌متر)
|
گونه‌ها |
محلول اتانول 20 درصد |
محلول اتانول 50 درصد |
محلول اتانول 80 درصد |
|
S. aureus |
4 |
10 |
0 |
|
E. coli |
0 |
0 |
0 |
|
P. aeroginosa |
0 |
0 |
0 |
|
X. oryzea |
12 |
13 |
9 |
|
Bacillus sp. |
0 |
8 |
5 |
|
Rizobium. cicil |
6 |
9 |
6 |
شکل 4. الف) اثر ضد میکروبی سیکلوتیدها بر S.aureus 1: m5 و 2:10 محلول اتانولی 50 درصد، 3: m5 و 4: m10 محلول اتانولی 80 درصد، 5: m10 محلول اتانولی 20 درصد. ب) اثر ضد میکروبی سیکلوتیدها بر E.coli. 1: m5 و 2:10 محلول اتانولی 50 درصد، 3: m5 و 4: m10 محلول اتانولی 80 درصد، 5: شاهد: سالین. ج) اثر ضد میکروبی سیکلوتیدها بر P.aeruginosa 1: m5 و 2:10 محلول اتانولی 50 درصد، 3: m5 و 4: m10 محلول اتانولی 80 درصد، 5: شاهد سالین. د) اثر ضد میکروبی سیکلوتیدها بر X.oryzea 4: m5 و 2:10 محلول اتانولی 50 درصد، 3: m5 و 1: m10 محلول اتانولی 80 درصد، 5: m10 محلول اتانولی 20 درصد. ه، و) اثر ضد میکروبی سیکلوتیدها بر باکتری‌های مفید خاک 1: m5 و 2:10 محلول اتانولی 50 درصد، 3: m5 و 4: m10 محلول اتانولی 80 درصد، 5: m10 محلول اتانولی 20 درصد
با توجه به نتایج تعیین توالی ژن و ترجمة آن به توالی آمینو اسیدی و سپس مقایسة توالی‌های به‌دست‌آمده با توالی‌های موجود در پایگاه‌های اطلاعاتی مشخص شد، پپتید پیشگویی‌شده از گونة V. odorata بیشترین شباهت را به پپتید vbc6 و پپتیدهای پیشگویی‌شده از نمونه‌های V. ignobilis و V. occultaبیشترین شباهت را به پپتید سیکلوتید 2d ثبت‌شده در Gene Bank داشت.
در مورد پپتید پیشگویی‌شده از گونة spathulata، نتایج 96 درصد مشابهت را با پپتید سیکلوویولاسین o13نشان می‌دهد. در پپتید پیشگویی‌شده از نمونة Viola odorataدر لوپ 3 آلانین جایگاه 36 با سرین جایگزین شده است. با توجه به خاصیت آب‌گریزی آلانین این پپتید نسبت به vbc6 که شبیه‌ترین پپتید به خود است، قابلیت اتصال بیشتری به غشا دارد. بنابراین، احتمالاً قابلیت درمانی بالاتری دارد. البته، سیکلوتید c3 استخراج‌شده از V. odorata نیز در این جایگاه آلانین دارد. به‌علاوه، در این لوپ سرین جایگاه 35 با ترئونین جایگزین شده است که به‌دلیل ویژگی‌های یکسان زنجیرة جانبی این دو آمینو اسید، تغییری در توانایی اتصال پپتید ایجاد نمی‌کند. همچنین در توالی پیشگویی‌شده از Viola occultaدر لوپ 2 آرژنین جایگاه 9 با تریپتوفان در cyclotide2d جایگزین شده است. با توجه به بیشتر بودن خاصیت آب‌گریزی در تریپتوفان احتمالاً توانایی کمتری برای اتصال به غشا دارد. در لوپ 3 نیز فنیل‌آلانین با ایزولوسین جایگزین شده است، هر دو آمینو اسید آب‌گریز است. برهم‌کنش مجموعة آمینو اسیدهای لوپ 2 و 3 تعیین‌کنندة نوع فعالیت سیکلوتیدهاست. در توالی پیشگویی‌شده از V. ignobilis در لوپ 3 فنیل‌آلانین جایگاه 15 با تریپتوفان از cyclotide2d جایگزین شده است. ویژگی زنجیرة جانبی این دو آمینو اسید یکسان است. همچنین، فنیل‌آلانین جایگاه 19 با لوسین جایگزین شده است. این آمینو اسیدها آب‌گریز است. با توجه به این تغییرات در پپتید پیشگویی‌شدة حاصل از نمونة V. ignobilisاحتمالاً ویژگی اتصال به غشای آن تغییر نخواهد کرد.
روش‌های مختلفی برای استخراج سیکلوتید از گیاه به‌کار می‌رود. تا سال 2005 روش Cleason با کمی تغییرات استفاده می‌شده است [21]. روش کروماتوگرافی سفادکس، پارتیشن‌بندی حلال- حلال و کروماتوگرافی تعویض یونی روش‌هایی بود که در سال‌های بعد استفاده شد [22]. تست Tricine-SDS-PAGE نشان داد غلظت سیکلوتید در محلول اتانولی 50 درصد حاصل از شست‌وشوی ستون SPE نسبت به دو محلول دیگر بیشتر است. مطالعات آثار ضدمیکروبی این محلول‌ها را نشان داد. اثر ضدمیکروبی محلول اتانولی 50 درصد بیشتر است که تأییدکنندة یافته‌های مطالعه‌های هاشم‌پور و همکاران [16] و دلیر و همکاران [15] است.
فعالیت‌های مختلف سیکلوتیدها ازجمله فعالیت‌های ضدویروسی، ضدمیکروبی، ضدکرمی و ضدسرطانی موضوع بسیاری از پژوهش‌ها قرارگرفته است. سیکلوتیدهای سنتزی شامل kalataB1 است علیه باکتری‌های گرم- مثبت مثل استافیلوکوکوس اورئوس در غلظت‌های زیر میکرومولار فعال است، ولی علیه باکتری‌های گرم- منفی نسبتاً غیرفعال است، که با نتایج ذکرشده در این بخش سازگار است [23].
پرانتیگ و همکاران اثر cycloviolacinO2 را علیه طیفی از باکتری‌های گرم- مثبت و گرم- منفی مطالعه کردند و دریافتند این سیکلوتید علیه سویه‌های گرم- منفی اثر بیشتری دارد [10]. سیکلوتیدهای مورد استفاده در این پژوهش در بین باکتری‌های بیماری‌زای انسانی بیشترین اثر را روی Staphylococcus aureusدارد، به‌طوری که تأثیر آن روی اشرشیا کولی و سودوموناس آئروجینوزا تقریباً صفر است.
مطالعة اثر ضدمیکروبی روی باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی و مفید خاک محدود به پژوهشی است که دلیر و همکاران [15] انجام داد.
مجموعة پپتیدی به‌کاررفته در این مطالعه بیشترین اثر را روی زانتوموناس اوریزوآ دارد. قطر هالة عدم رشد (13 میلی‌متر) آشکارا از سایر باکتری‌های به‌کاررفته بیشتر است. این یافته با نتایج دلیر و همکاران [15] مطابقت دارد. با توجه به نقش ذاتی سیکلوتیدها در دفاع میزبان این یافته توجیه می‌شود. در بررسی امکان آفت‌کشی سیکلوتید، باکتری‌های مفید خاک تحت تأثیر سیکلوتیدهای استخراج‌شده قرارگرفت. حساسیت این باکتری‌ها از باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی کمتر است.
این نتایج نشان می‌دهد استفاده از سیکلوتید در آفت‌کشی نیاز به تغییرات لازم از طریق مهندسی پروتئین دارد تا اثر آن روی باکتری‌های مفید خاک به حداقل برسد. با توجه به انعطاف‌پذیری ساختار سیکلوتید که در قسمت اول به آن اشاره کردیم، انجام چنین تغییراتی امکان‌پذیر است.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه الزهرا (س) برای حمایت مالی از این پژوهش تشکر و قدردانی می‌کنیم.
)