مقایسه­ی تحریک­پذیری نورون­های هیپوکمپ در مراحل موضعی و عمومی تشنج­های ایجاد شده به روش کیندلینگ در موش صحرایی

حمیرا مرادی چمه¹، سعید سمنانیان²، مهیار جان احمدی³، امیر شجاعی¹، اعظم عسگری¹، سید جواد میرنجفی زاده²

¹دانشجوی دکترای گروه فیزیولوژی، دانشکده­ی علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس تهران، تهران، ایران

²استاد گروه فیزیولوژی، دانشکده­ی علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس تهران، تهران، ایران

³استاد مرکز تحقیقات علوم اعصاب و گروه فیزیولوژی، دانشکده­ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران، تهران، ایران

‏نشانی نویسنده مسئول: تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم پزشکی، گروه فیزیولوژی،  دکتر سیدجواد میرنجفی زاده

E-mail: mirnajaf@modares.ac.ir @yahoo.com

چکیده

زمینه و هدف: کیندلینگ آمیگدال با تغییر در ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک سلول­های هرمی ناحیه­ی CA1هیپوکمپ همراه است. اما به­درستی مشخص نیست که بروز این تغییرات در طی روند کیندلینگ آمیگدال از چه زمانی و در کدام مرحله تشنجی رخ می­دهد. بنابراین، در این تحقیق ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­های هرمی ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ به دنبال کیندلینگ موضعی آمیگدال، بررسی و با تغییرات ایجاد شده در کیندلینگ کامل مقایسه شد.

مواد و روشها: حیوانات با روش کیندلینگ سریع با اعمال پالس­های مربعی 1 میلی ثانیه­ای، فرکانس 50 هرتز، 12 بار در روز، به مدت 3 ثانیه و با فواصل 5 دقیقه­ای تحریک می­شدند. در یک گروه از حیوانات با مشاهده­ی مرحله­ی 2 تشنج (گروه کیندلینگ موضعی) و در گروهی دیگر با مشاهده مرحله­ی 5 تشنج (کیندلینگ کامل) تحریکات متوقف و 24 ساعت بعد ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­های ناحیه  CA1هیپوکمپ به روشWhole-Cell Patch Clampبررسی شد.

یافته­ها: نتایج حاصل از کیندلینگ آمیگدال نشان داد شاخص سازش، رئوباز، زمان تاخیری تا وقوع اولین پتانسیل عمل و دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب در گروه کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل نسبت به گروه کنترل به طور معناداری، کاهش و تعداد پتانسیل عمل افزایش یافت.

نتیجه­گیری: نتایج این تحقیق نشان می­دهند با وجود این­که گروه کیندلینگ موضعی نسبت به گروه کیندلینگ کامل تحریکات کمتری دریافت می‌کند، اما همانند گروه کیندلینگ کامل، ویژگی های الکتروفیزیولوژیک نورون های هرمی ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ را تغییرداده و باعث افزایش تحریک پذیری این نورون ها می­شود.

مقدّمه

صرع، یک بیماری مزمن است که با تخلیه­های ناگهانی و همزمان مجموعه­ای از نورون­ها همراه می باشد.

شایع­ترین فرم صرع، صرع لوب گیجگاهی در بالغینی است که به درمان مقاوم هستند (3-1) و معمولا به­دنبال اختلالات مغزی نظیر سکته، تروما و بیماری­های نورودژنراتیو ایجاد می­شود. یکی از مدل­های آزمایشگاهی برای بررسی صرع، کیندلینگ می باشد که به دو نوع شیمیایی و الکتریکی تقسیم می­گردد. در کیندلینگ الکتریکی، تحریکات الکتریکی ضعیف با فواصل زمانی مشخص به منطقه­ی خاصی از مغز اعمال می­شود. در ابتدا این محرک ضعیف قادر به ایجاد تشنج نیست، ولی به مرور زمان همان تحریک ضعیف سبب رفتار تشنجی کلینیکی در حیوان می­گردد. کیندلینگ به­عنوان مدل مناسبی برای صرع موضعی پیچیده که به­طور ثانویه عمومی می­شود معرفی شده است. در کیندلینگ الکتریکی تحریکات می­بایستی قادر به ایجاد تخلیه­های متعاقب (Afterdischarge) که ناشی از فعالیت همزمان گروهی از نورون­هاست، باشند (5‚4). درطی روند کیندلینگ، امواج تخلیه­ی متعاقب در ابتدا محدود به ناحیه­ی تحریک شده است، اما پس از اعمال چندین تحریک این امواج در مسیرهای نورونی نزدیک کانون منتشر می­شوند.

کیندلینگ موضعی، یک مدل آزمایشگاهی برای صرع لوب گیجگاهی است که ناشی از فعالیت گروه کوچکی از نورون­های یکی از نیمکره­های مغز بوده که کانون تشنج را تشکیل می‌دهد. علایم تشنجات کانونی بستگی به محل کانون تشنج دارد و می‌تواند شامل علایم حسی، حرکتی و اتونوم باشد و ممکن است در آن تشنج مشاهده نشود. در کیندلینگ موضعی، تخلیه­های متعاقب به نواحی دورتر از کانون گسترش نمی­یابد (5) و کاهش تعداد سلول­ها مشاهده نمی­شود (6). مرحله­ای از روند کیندلینگ که تشنج­ها محدود به کانون تحریک می­باشند، کیندلینگ موضعی نامیده می­شود. درکیندلینگ موضعی حیوانات مراحل رفتاری 2و3 تشنج را نشان می­دهند (7).

در حیوان کامل کیندل شده تحریکات کیندلینگ باعث تشنجات تونیک ـ کلونیک می شود، درحالی­که در کیندلینگ موضعی بعد از تحریکات کیندلینگ تشنجات تونیک و کلونیک مشاهده نمی­شود.

در بین نواحی مختلف مغز، هیپوکمپ ناحیه­ی مهمی در گسترش و تقویت امواج تشنجی است و در صرع لوب گیجگاهی تغییرات زیادی در فعالیت نورون‌های این ناحیه مشاهده می­شود (8). وایسر و همکاران Wieser  در سال 1988 دریافتند که دو ناحیه­ی زیر قشری هیپوکمپ و آمیگدال نقش مهمی در شروع تشنج دارند. نتایج ثبت­های آن­ها نشان داد که 25درصد تشنجات در صرع لوب گیجگاهی از هیپوکمپ، 10درصد از آمیگدال و 65درصد از این دو ناحیه به­طور همزمان شروع می­شوند. آستانه­ی تشنج در هیپوکمپ و آمیگدال پایین می­باشد و شاید این امر در مقاوم بودن این نواحی به داروهای ضد صرعی نقش داشته باشد (9).

یکی ازعوامل مؤثر در روندکیندلینگ، تعداد تحریکات می­باشد. نشان داده شده که درطی روند کیندلینگ فعالیت حرکتی حیوانات با تعداد تحریکات رابطه­ی مستقیم دارد (10). با افزایش تعداد تحریکات و تشدید مراحل رفتاری تشنج، ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­ها علاوه بر کانون تحریک، در نقاطی از مغز که از نظر آناتومیکی دورتر از کانون تحریک هستند ولی ارتباط آناتومیکی نزدیکی با کانون تحریک دارند، تغییرمی­کند (11) .اما به­درستی مشخص نیست که این تغییرات الکتروفیزیولوژیک آیا پس از ایجاد کیندلینگ کامل در حیوانات قابل مشاهده است یااین­که در مراحل قبل ازآن نیز چنین تغییراتی ایجاد می­شود. بنابراین در این تحقیق ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­های ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ در موش­هایی که با تحریک الکتریکی آمیگدال مرحله­ی 2 (کیندلینگ موضعی) یا مرحله­ی 5 (کیندلینگ کامل) را نشان دادند، مورد بررسی قرارگرفت.

مواد و روش ها

حیوانات

دراین تحقیق از موش­های صحرایی نر نژاد    Wistar با محدوده­ی وزنی 80 تا 90گرم استفاده شد. حیوانات از انستیتو پاستور کرج، تهیه و به­صورت منفرد در قفس­های جداگانه نگهداری ‌شدند. دوره­ی روشنایی و تاریکی 12 ساعته رعایت می‌شد. آب و غذا آزادانه در اختیار حیوانات قرارمی­گرفت. تمامی مراحل کار براساس پروتکل کار با حیوانات آزمایشگاهی تدوین شده از سوی کمیته­ی اخلاق پزشکی دانشکده­ی علوم پزشکی دانشگاه تربیت مدرس صورت گرفت.

جراحی حیوانات و ایجاد مدل کیندلینگ

هر حیوان با تزریق داخل صفاقی کتامین (mg/kg100) و زایلازین (mg/kg 10) بیهوش شد. پس از بیهوش شدن حیوان، موهای سر آن، کوتاه و سرحیوان در دستگاه استریوتاکس (Stoelting, USA) ثابت ‌شد. پس از شست­وشوی پوست سر حیوان با بتادین، با استفاده از تیغ جراحی از فاصله­ی بین دو چشم تا بین گوش­ها برش داده ‌شد. سپس پوست و فاسیای زیر آن کاملا" کنار زده تا سطح استخوان جمجمه و نقطه برگما مشخص شود. پس از مشخص شدن نقطه­ی برگما، براساس اطلس واتسون و پاکسینوس  Paxinos and Watson (12)، مختصات هسته­ی قاعده­ای ـ جانبی آمیگدال (mm4/2+ =Ap،mm8/4± =L وmm6/8 =V نسبت به پرده­ی سخت شامه) که محل قرارگیری نوک الکترود سه قطبی است، روی سطح استخوان جمجمه به دقت تعیین و سپس با مته­ی دستی آن نقطه سوراخ گردید و الکترود 3 قطبی تحریک و ثبت در ناحیه­ی قاعده­ای ـ جانبی آمیگدال در نیمکره­ی راست قرارگرفت. الکترودها ازجنس فولاد ضد زنگ با پوشش تفلون و قطر 127 میکرومتر (A.M System, USA) بودند. سپس دو الکترود تک قطبی ( الکترودهای مرجع و زمین) با استفاده از پیچ لحیم شده به آنها، برروی جمجمه در لوب پیشانی متصل شدند. دو پیچ کوچک دیگر برای استحکام روی نقاط دیگری ازجمجمه وصل، و الکترودها و پیچ­ها به وسیله­ی سیمان دندان­پزشکی روی سطح جمجمه ثابت شدند. در پایان کارگذاری الکترودها، پین­های متصل به آنها داخل مادگی سوکت مخابراتی قرارداده و سوکت توسط سیمان دندان­پزشکی به روی سر حیوان محکم شد.

پوست سر حیوان در سمت پس سری بخیه زده ‌شد. پس از جراحی، یک هفته تا ده روز برای ترمیم زخم­ها به حیوان استراحت داده‌شد.

پس از طی دوره­ی بهبودی، برای ایجاد تشنج از روش کیندلینگ سریع استفاده شد. در این روش حیوانات با موج مربعی تک­فازی با مدت پالس ۱ میلی ثانیه، فرکانس ۵۰ هرتز، شدت آستانه­ی تولید امواج تخلیه­ی متعاقب و به مدت ۳ ثانیه تحریک شدند .این تحریکات به فاصله­ی هر 5 دقیقه یک بار و 12 بار در روز اعمال گردید. در گروهی ازحیوانات (گروه کیندلینگ موضعی) اعمال تحریکات تا زمان بروز مرحله­ی 2 تشنج ادامه یافت. اما در گروهی دیگر (گروه کیندلینگ کامل) این تحریکات تا نشان دادن مرحله­ی 5 تشنج ادامه پیدا می‌کرد. مراحل رفتاری تشنج براساس معیارهای راسین Racine به صورت ذیل تقسیم­بندی شد:

مرحله­ی نخست: انقباضات عضلانی در صورت Facial clonus، مرحله­ی دوم: حرکت دادن سر به طرف بالا و پایین Head nodding ، مرحله­ی سوم: انقباضات عضلانی اندام حرکتی جلویی Forlimbcolonus. مرحله‌ی چهارم: ایستادن روی هر دو اندام حرکتی عقبی همراه با انقباضات عضلانی اندام­های حرکتی جلویی Rearing و مرحله­ی پنجم: ایستادن روی هر دو پا همراه با از دست دادن تعادل و افتادن Rearing & Falling..برای بررسی ویژگی های الکتروفیزولوژیک سلول­های هرمی ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ از روشWhole-Cell Patch Clamp  استفاده شد.

ثبت داخل سلولی با روشWhole-Cell Patch Clamp

موش­های صحرایی که تحریکات کیندلینگ دریافت کرده بودند و وزن آن­ها پس از حدود دو هفته به 150-120 گرم افزایش یافته بود، 24 ساعت پس از اعمال آخرین تحریک کیندلینگ، با استفاده از اتر، بیهوش و سر آن­ها جدا شد. مغز به سرعت برداشته شده و در محلول برش­گیری سرد (دمای 4-0 درجه سانتی­گراد) و کربوژنه ( 95 درصد CO₂و 5 درصد O₂) گذاشته شد. برش­های عرضی از هیپوکمپ راست با ضخامت400 میکرومتر با استفاده از ویبروتوم (Vibrotome 1000 plus, USA)  تهیه شد. محلول aCSF (مایع مغزی- نخاعی مصنوعی) Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) برش گیری که دارای غلظت کلسیم پایین است برحسب میلی مولار حاوی KCl5/2،CaCl₂5/0، MgCl₂ 2، NaH₂PO₄ 1،NaHCO₃ 2/26، سوکروز 238 و D- گلوکز 11 بود.

اسمولاریته این محلول در محدوده­ی 294 تا 300 میلی اسمول و pH آن در محدوده­ی 3/7 تا4/7 تنظیم گردید (13). برش­های تهیه شده در محلولaCSF کربوژنه به مدت 1 ساعت در درجه حرارت35-32 درجه­ی سانتی­گراد، انکوبه و پس از آن تا هنگام آزمایش در محلول ذکرشده در درجه­ی حرارت اتاق نگهداری شدند. سپس برش­های تهیه شده به محفظه­ی ثبت منتقل شدند. محفظه­ی ثبت با محلول aCSF استاندارد کربوژنه به­طور مداوم با سرعت 2-1 میلی لیتر در دقیقه پرفیوژ شد.ACSF  استاندارد برحسب میلی مولار حاوی NaCl125،KCl 3، NaH₂PO₄ 25/1،  NaHCO₃25، D-Glucose10 ، CaCl₂ 2،MgCl₂3/1 بود (14).

ثبت  :Whole cell patch clampاز جسم سلولی نورون­های هرمی ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ و در دمای اتاق (23 تا 25 درجه سانتی­گراد ) انجام گردید. برای مشاهده­ی نورون­ها از میکروسکوپ (مدل Axioskop 2 FS MOT، شرکت Carl Zeiss، آلمان) مجهز به دوربین مادون قرمز (IR CCD camera، مدل IR-1000، شرکت MTI، آمریکا) و لنز شیئی با بزرگ‌نمایی 40× استفاده شد. الکترودهای مورداستفاده در این ثبت ازمیکروپیپت­های شیشه­ای فیلامنت دار از جنس بوروسیلیکات (قطر خارجی 5/1 میلی­متر، مدل GC150-11، شرکت Harvard Apparatus، انگلیس) بااستفاده از دستگاه کشنده میکروالکترود افقی (مدلP-97، شرکت Sutter instrument ،آمریکا) طی چهار مرحله کشش تهیه شدند. ترکیب محلول داخل پیپت که مشابه محلول داخل سلولی است، برحسب میلی مولار شامل K⁺-gluconate 130،CaCl₂5/0، MgCl₂ 2، EGTA1، ATP 2Na54/2، HEPES10 می­باشد (2/7 =pH، اسمولاریته 290 میلی اسمول بر کیلوگرم) (16‚15).

مقاومت پیپت ‏پس از پرشدن با محلول داخل سلولی و قرارگرفتن نوک آن­ها در aCSF، بین 6-4 مگا اهم بود. امواج الکتروفیزیولوژیک با فرکانس کمتر از 3 کیلو هرتز و سرعت نمونه­برداری 10 کیلو هرتز، با کمک آمپلی فایر (مدل Multiclamp 700B، شرکتAxon ، آمریکا) مجهز به سیستم مبدل آنالوگ به دیجیتال (مدل Digidata 1440، شرکتAxon ، آمریکا)،گرفته و سپس به رایانه منتقل شدند. آنگاه با استفاده از نرم­افزار PClamp نسخه­ی 10 (شرکتAxon ، آمریکا)، مشاهده و بر روی رایانه ذخیره شدند. تحلیل الکتروفیزولوژیک داده­ها با استفاده از نرم افزارClampfit نسخه­ی 4/10 انجام گردید. فعالیت برانگیخته­ی سلول با استفاده از پروتکل کلمپ جریان ثبت شد. در پروتکل کلمپ جریان برای اندازه­گیری فعالیت برانگیخته­ی غشایی جریان­های دپلاریزه­کننده (0 تا 500 پیکو آمپر) و دندان اره­ای (200-0 پیکوآمپر) به مدت 1000 میلی ثانیه به سلول تزریق شدند.

قبل ازانجام هرآزمایش، باوجود مشاهده­ی مستقیم سلول هرمی زیر میکروسکوپ، جریان دپلاریزه کننده از 0تا 500 پیکو آمپر به­مدت 600 میلی ثانیه به سلول تزریق شد و اگر درثبت پتانسیل غشا، سازش  Adaptation صورت گرفت (فاصله بین اسپایک­ها به‌تدریج زیادترمی­شد)، سلول مورد نظر به لحاظ الکتروفیزیولوژی به­عنوان یک سلول هرمی ناحیه­یCA1  تأیید می­گردید.

گروه­های آزمایشی

گروه کنترل: در این گروه جراحی انجام نمی­شد و فقط ثبت داخل سلولی انجام می­گرفت.

گروه شم: دراین گروه حیوانات جراحی می‌شدند و پس ازطی دوره­ی بهبودی، به­مدت 3 روز (میانگین مدت زمان لازم برای رسیدن به مرحله­ی 2 تشنج در گروه کیندل) یا 5 روز (میانگین مدت زمان لازم برای رسیدن به مرحله­ی 5 تشنج) نگهداری شدند. از آنجا که تفاوت معناداری در هیچ یک از کمیت­های ثبت شده در روش ثبت داخل سلولی بین گروه کنترل و شم مشاهده نشد، داده­های این دو گروه با هم ادغام و به­عنوان یک گروه کنترل واحد درنظرگرفته شد.

گروه کیندلینگ موضعی: این گروه هر روز 12 تحریک با فواصل 5 دقیقه دریافت می­کردند و این تحریکات تا زمانی که مرحله­ی 2 تشنج را نشان بدهند، ادامه می­یافت.

گروه کیندلینگ کامل: این گروه هر روز 12 تحریک با فواصل 5 دقیقه دریافت می­کردند و این تحریکات تا زمانی که مرحله­ی 5 تشنج را نشان بدهند، ادامه می­یافت.

1 روز پس از اعمال آخرین تحریک کیندلینگ ثبت داخل سلولی به روشWhole cell patch clamp از جسم سلولی نورون های هرمی CA1 هیپوکمپ انجام می شد.

کمیت­های مورد اندازه گیری

در گروه­های آزمایشی با استفاده از کلمپ جریان، کمیت­های ذیل اندازه­گیری شد:

الف) شاخص سازش: برای اندازه­گیری این کمیت از پالس­های مربعی تحریکی صفر تا 500+ پیکوآمپربا فواصل 100 پیکوآمپر به­مدت 600 میلی ثانیه استفاده شد.

در هر پالس تحریکی، میانگین فاصله بین اسپایک­ها برای حداقل 3 اسپایک اول و نیز برای حداقل 3 اسپایک آخر  محاسبه می­شد. سپس از تقسیم میانگین فاصله­ی بین اسپایک­ها سه اسپایک اول بر میانگین فاصله‌ی بین اسپایک ها سه اسپایک آخر اندکس سازش به­دست آمد.

ب) دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب  Post- AHP Amplitude پایان پالس دپلاریزه­کننده: برای اندازه­گیری این کمیت نیز از پالس­های مربعی تحریکی صفر تا 500+ پیکوآمپر با فواصل 100 پیکوآمپر به مدت 600 میلی ثانیه استفاده شد. دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب با اندازه­گیری اختلاف پتانسیل پایه­ی غشاء قبل از تزریق جریان دپلاریزه تا قله­ی بخش هیپرپلاریزه محاسبه شد.

ج) رئوباز(حداقل جریان مورد نیاز برای ایجاد پتانسل عمل): جریان دپلاریزه به­صورت دندان اره­ای، اعمال و اختلاف جریان از شروع اعمال جریان دپلاریزه کننده دندان اره­ای تا آستانه­ی تولید پتانسیل عمل درنظرگرفته شد.

د) تعداد اسپایک­ها: برای اندازه­گیری این کمیت جریان دپلاریزه به­صورت دندان اره­ای، اعمال و تعداد اسپایک­های ایجادشده در طی اعمال جریان شمرده شد.

ه) زمان تاخیری شروع پتانسیل عمل: برای اندازه‌گیری این کمیت جریان دپلاریزه به­صورت دندان اره­ای، اعمال و اختلاف فاصله­ی زمانی میان شروع پروتکل دندان اره­ای تاایجاد اولین پتانسیل محاسبه گردید.

تجزیه وتحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری داده­های مربوط از نرم­افزار  GraphPad Prismنسخه­ی 01/6 (شرکت نرم‌افزاری GraphPad، آمریکا) به روش تجزیه و تحلیل واریانس یک­طرفه و آزمون متعاقب  Bonferroniاستفاده شد. داده­ها به صورت (میانگین± خطای معیار میانگین) و 5 صدم P<به­عنوان حداقل سطح معناداری منظورگردید.

یافته­ها

آنالیز آماری نتایج حاصل از ثبت داخل سلولی نشان داد که به­دنبال جریان دپلاریزه­کننده­ی 200 تا 500 پیکوآمپر شاخص آداپتاسیون به­طور معناداری در گروه کیندلینگ موضعی (25=n) و کیندلینگ کامل (15=n) نسبت به گروه کنترل (15=n) در سلول­های هرمی ناحیه‌ی CA1 هیپوکمپ کاهش یافت. این کاهش ازنظر آماری معناداری بود(001/0p<) (شکل 1- الف)، اما اختلاف معناداری در این کمیت بین دو گروه کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل وجود نداشت.

دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب در محدوده­ی تزریق جریان دپلاریزه­کننده­ی 200 تا 500 پیکو آمپر در گروه کیندلینگ موضعی نسبت به گروه کنترل کاهش نشان داد ( 001/0p<) (18=n). در گروه کیندلینگ کامل (7=n) نیز این کمیت نسبت به گروه کنترل (7=n) کاهش نشان داد. ( 001/0p<) (شکل 1- ب)، اما اختلاف معناداری بین میزان کاهش این کمیت در دو گروه کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی وجود نداشت.

اعمال تحریکات کیندلینگ باعث افزایش معنادار تعداد پتانسیل­های عمل به دنبال اعمال جریان دپلاریزه کننده راست گوشه­ای در هر دو گروه کیندلینگ موضعی (4/2±3/13) (23=n) و کیندلینگ کامل (9/1±5/15) (14=n) نسبت به گروه کنترل (3/3±85/10) (11=n) شد، اما همانند کمیت­های قبلی، بین دو گروه کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی تفاوتی دیده نشد.

اعمال تحریکات کیندلینگ باعث افزایش معنادار تعداد پتانسیل­های عمل به دنبال جریان دپلاریزه­کننده­ی دندان اره­ای در هر دو گروه کیندلینگ موضعی (7/0±5/12) (24=n) و کیندلینگ کامل (7/0±5/14) (24=n) نسبت به گروه کنترل (5/0±4/8) (11=n) شد  (001/0p<، شکل 2- الف)، اما همانند کمیت­های قبلی، بین دو گروه کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی تفاوتی دیده نشد. میزان رئوباز در گروه کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل کاهش یافت. به­طوری­که تفاوت معناداری در این کمیت بین گروه کیندلینگ موضعی (3/4±64/69 پیکوآمپر) (24=n) و کیندلینگ کامل (5/5±27/56 پیکوآمپر) (24=n) نسبت به گروه کنترل (5/6±2/102 پیکوآمپر) (11=n) مشاهده شد (001/0p<، شکل 2- ب)، اما بین دو گروه کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی تفاوتی وجود نداشت. به­دنبال اعمال جریان دپلاریزه‌کننده­ی دندان اره­ای، زمان تاخیری تا شروع اولین پتانسیل عمل نیز در گروه کیندلینگ موضعی (5/20±4/383 میلی ثانیه،24=n) و کیندلینگ کامل (8/31±2/319 میلی ثانیه ،24=n) نسبت به گروه کنترل (8/34±2/519 میلی ثانیه،11=n) کاهش معناداری داشت (001/0p<، شکل 2- ج)، اما  تفاوت معناداری بین گروه­های کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی در این دو کمیت نیز به چشم نخورد.

بحث

هدف از این تحقیق، بررسی ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­های ناحیه­ی CA1 هیپوکمپ در موش­هایی است که با تحریک الکتریکی آمیگدال مرحله­ی 2 (کیندلینگ موضعی) یا مرحله­ی 5 (کیندلینگ کامل) را نشان دادند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد تحریکات کیندلینگ فعالیت ذاتی نورون­های هرمی CA1 هیپوکمپ را تغییرمی­دهد. در سلول­های هرمی گروه­هایی که تحریکات کیندلینگ را دریافت می­کردند، شاخص سازش، رئوباز، زمان تاخیری تا وقوع اولین پتانسیل عمل، دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب نسبت به گروه کنترل کاهش و تعداد اسپایک­ها افزایش یافت که این امر نشان‌دهنده­ی تحریک­پذیری این نورون­ها در نتیجه­ی تحریکات کیندلینگ می­باشد. اما نکته­ی جالب این بود که میزان تغییر کمیت­های فوق در هر دو گروه کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی یکسان بود و تفاوت آماری معناداری بین دو گروه مشاهده نشد.

نتایج به­دست آمده از فعالیت­های برانگیخته با استفاده از پروتکل کلمپ جریان، بیانگر کاهش شاخص سازش در گروه­های کیندلینگ کامل و کیندلینگ موضعی نسبت به گروه کنترل بود. یکی از عوامل مؤثر بر میزان شاخص سازش اندازه­ی دامنه هیپرپلاریزاسیونی است که به­دنبال هر پتانسیل عمل ایجاد می­شود. این هیپرپلاریزاسیون در تنظیم تحریک­پذیری و انتشار فعالیت صرعی نقش دارد و جلوگیری از تغییرات آن به­دنبال تشنج به­عنوان یک هدف در درمان و کنترل بیماران صرعی در نظرگرفته می­شود. کاهش دامنه­ی این هیپرپلاریزاسیون، باعث افزایش پاسخ سلول به محرک تحریکی و کاهش آداپتاسیون  می­گردد. بنابراین کاهش دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب و به­دنبال آن آداپتاسیون، باعث افزایش تحریک­پذیری و فعالیت همزمان نورون­های هرمی ناحیه­ی CA1 می­شود (17). دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب به جریان پتاسیمی I_m و I_k,Ca⁺² وابسته هستند (18). گزارش­شده­است که مسدودکننده­های کانال کلسیم با کاهش  I_k,Ca⁺²باعث کاهش دامنه­ی هیپرپلاریزاسیون متعاقب و درنتیجه افزایش فرکانس پتانسیل عمل و فعالیت نورون­ها می­شود (20‚19).

همان­گونه­که در نتایج بیان شد، به­دنبال اعمال جریان دپلاریزه­کننده، تعداد پتانسیل­های عمل در گروه‌های کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل نسبت به گروه کنترل افزایش یافت. این افزایش تعداد پتانسیل­های عمل در ضمن کلمپ جریان موجب افزایش ورود کلسیم و متعاقب آن دپلاریزاسیون غشا می­شود (23-21).

دپلاریزاسیون غشا خود باعث غیرفعال شدن کانال­های پتاسیمی وابسته به کلسیم به دنبال وقوع  قطاری از پتانسیل های عمل می­گردد (24). به دنبال غیرفعال شدن کانال­های پتاسیمی وابسته به کلسیم، دامنه­ی پتانسیل هیپرپلاریزاسیون متعاقب و آداپتاسیون کاهش می­یابد.

اعمال تحریکات کیندلینگ در این تحقیق در هر دو گروه کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل به­طور مشابه تعداد اسپایک­ها را در سلول­های هرمی ناحیه­ی  CA1به­دنبال تزریق جریان دندان اره­ای افزایش داد. ازطرفی دیگر، رئوباز و زمان تأخیری تا شروع اولین پتانسیل عمل در گروه­های کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل کاهش یافت. کاهش رئوباز نشان­دهنده­ی این است که برای شلیک اولین پتانسیل عمل در حین اعمال جریان دندان اره­ای، به میزان جریان تزریقی کمتری نیاز است.  این پدیده خود نشان­دهنده­ی افزایش تحریک­پذیری نورون­ها می باشد. درهمین راستا، کاهش زمان تأخیری تا مشاهده‌ی اولین پتانسیل عمل درحین اعمال جریان دندان اره­ای نیز تأییدکننده­ی افزایش تحریک­پذیری نورون در نتیجه­ی فرایند صرع­زایی است. این کمیت­ها به هدایت یونی وابسته است. تغییر این کمیت­ها می­تواند ناشی از افزایش دانسیته و کینتیک کانال سدیمی وابسته به ولتاژ باشد. کانال­های سدیمی وابسته به ولتاژ در ایجاد پتانسیل عمل و تحریک­پذیری نقش دارند (27-25). مطالعات قبلی نشان داده­اند که موتاسیون در این کانال­ها منجر به نوعی صرع ژنتیکی می شود. بلومنفیلد  Blumenfeld و همکارانش پیشنهادکردند که فعالیت کانال سدیمی Na_v1.6و به­دنبال کیندلینگ افزایش می­یابد و این  کانال­ها در افزایش تحریک­پذیری نقش دارند (28). واکسمن Waxman گزارش کرد که جریان Na persistant به دنبال کیندلینگ افزایش می­یابد (29). به­علاوه، بعد از کیندلینگ تعداد کانال­های سدیمی در دسترس و کلسیم داخل سلولی افزایش می­یابد که این عامل هم باعث افزایش تحریک­پذیری می­شود (31‚30). مطالعات قبلی نشان داده­اند که تحریکات کیندلینگ جریان­های کلسیمی نوع T را افزایش می­دهند (22‚21). همچنین گزارش شده که بیان کانال­های سدیمی وابسته به ولتاژ به دنبال تحریکات کیندلینگ افزایش می­یابد (29).

عدم وجود تفاوت معنادار در این خصوصیات الکتروفیزولوژیک نورون­ها در گروه­های کیندلینگ موضعی و کیندلینگ کامل نشان­دهنده­ی این است که میزان افزایش تحریک­پذیری نورون­ها در گروه­هایی که به­صورت موضعی یا کامل کیندل شدند، یکسان است. این بدان معناست که در مدل کیندلینگ هر چند ازنظر رفتاری بین مراحل تشنجی 2و 5 تفاوت وجود دارد، اما ازنظر تغییر درخصوصیات الکتروفیزیولوژیک سلول­ها مراحل 2 و 5 مشابه یکدیگر هستند. به عبارتی دیگر، وقتی حیوان به مرحله­ی 2 تشنج می­رسد، سطح تحریک­پذیری نورونی همانند حیوانی است که کاملاً کیندل شده می­باشد. اما باید دقت نمود که این تشابه فقط در سطح یک نورون در این مطالعه مورد بررسی قرارگرفت و مطمئناً خصوصیات مدارهای نورونی در حیواناتی که مرحله­ی 2 تشنج را نشان می­دهند نسبت به حیواناتی که به مرحله­ی 5 می‌رسند، کاملاً متفاوت است و این تفاوت و عامل اختلاف در مراحل رفتاری تشنج می­باشد.

 این یافته ها نشان می­دهد که کیندلینگ موضعی آمیگدال با تغییر ویژگی­های الکتروفیزیولوژیک نورون­های هرمی ناحیه­یCA1  هیپوکمپ باعث افزایش تحریک‌پذیری این نورون­ها می­شود.

تشکر و تقدیر

حمایت مالی این تحقیق توسط معاونت پژوهشی دانشگاه تربیت مدرس و و صندوق حمایت از پژوهشگران ریاست جمهوری (Grant # 92040251) صورت گرفته است و بدین وسیله نویسندگان مراتب تشکر خود را از این مراکز اعلام می­کنند.

References

1. Picot MC, Baldy-Moulinier M, Daure`s JP, Dujols P, Crespel A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 2008; 49(7): 1230–8.
2. Téllez-Zenteno JF, Hernández-Ronquillo L. A Review of the Epidemiology of Temporal Lobe Epilepsy. Epilepsy Research and Treatment. 2012; 2012: 1-5.
3. Berg AT, Berkovic SF, Brodie MJ, Buchhalter J, Helen J, Emde Boas W, et al. Revised terminology and concepts for organization of seizures and epilepsies: report of the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005–2009. Epilepsia. 2010; 51(4): 676–85.
4. McIntyre DC, Gilby KL. Kindling as a model of human epilepsy. Can J Neurol Sci. 2009;36:  Suppl 2:S33-5.
5. Ebertram E. The relevance of kindling for human epilepsy. Epilepsia. 2007;48: Suppl 2:65-74.
6. Leung LS, Wu C, Wu K, Shen B, Sutherland R, Zhao D. Long lasting behavioral and electrophysiological effects induced by partial hippocampal kindling. In: Corcoran ME, Moshe S, editors. Kindling 5.New York: Plenum; in press. 1997: 395-408.
7. Racine R, Rose PA, Burnham WM. Afterdischarge thresholds and kindling rates in dorsal and ventral hippocampus and dentate gyrus. J Neurol Sci.1977;4: 273-8.
8. Wasterlain CG, Farber DB, Fairchild D. Cholinergic kindling: What has it taught us about epilepsy? J Neural Transm. 1985;63(2):119-32.
9. Wieser HG. Human limbic seizures: EEG studies, origin, and patterns of spread. In: Meldrum BS, Ferendelli JA, Weiser HG, editors. Anatomy of Epileptogenesis, Current problems in epilepsy. London: John Libbey. 1988; 6: 127–38.
10. Kalynchuk LE, Pinel JPJ, Treit D, Kippin TE. Changes in emotional behavior produced by long-term amygdala kindling in rats. Biol Psychiatry.1997; 41(4): 438–51.
11. Ghotbedin Z, Janahmadi M, Mirnajafi-Zadeh J, Behzadi G, Semnanian S. Electrical low frequency stimulation of the kindling site preserves the electrophysiological properties of the rat hippocampal ca1 pyramidal neurons from the destructive effects of amygdala kindling: The basis for a possible promising epilepsy therapy. Brain Stimul. 2013; 6(4): 515-23.
12. Paxinos G, Watson C. The rat Brain in stereotaxic coordinates. New York: Academic Press; 1986.
13. Vreugdenhil M, Wadman WJ. Enhancement of calcium currents in rat hippocampal CA1 neurons induced by kindling epileptogenesis. Neurosciences. 1992; 49(2): 373-81.
14. Liu X, Leung LS. Partial hippocampal kindling increases GABAB receptor-mediated postsynaptic currents in CA1 pyramidal cells. Epilepsy Res. 2003; 57(1): 33-47.
15. Khazipov R, Khalilov L, Tyzio R, Morozova E, Ben-Ari Y, Holmes GL. Developmental changes in GABAergic actions and seizure susceptibility in the rat hippocampus. Eur J Neurosci. 2004; 19: 590-600.
16. Qi J, Yao J, Cheng F, Luscher B, Chen G. Down regulation of tonic GABA currents following epileptogenic stimulation of rat hippocampal cultures. J Physiol.2006; 577: 579-90.
17. Asprodini EK, Rainnie DG, Anderson AC, Shinnick-Gallagher P. In vivo kindling does not alter afterhyperpolarizations (AHPs) following action potential firing in vitro in basolateral amygdala neurons. Brain Res. 1992; 588(2): 329-34.
18. Faber ES, Sah P. Independent roles of calcium and voltage-dependent potassium currents in controlling spike frequency adaptation in lateral amygdala pyramidal neurons. Eur J Neurosci. 2005; 22(7):1627-35.
19. Madison DV, Nicoll RA, Actions of noradrenaline recorded intracellular in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons, in vitro. J Physiol.1986; 372: 221-44.
20. Madison DV,Nicoll RA, Control of the repetitive discharge of rat CA1 pyramidal neurones in vitro. J physiol.1984; 354: 319-31.
21. Cain SM, Snutch TP. T-type calcium channels in burst-firing, network synchrony, and epilepsy. Biochim Biophys Acta. 2013; 1828(7):1572-8.
22. Cheong E, Shin HS. T-type Ca² channels in absence epilepsy. Biochim Biophys Acta. 2013; 1828(7):1560-71.
23.  Siwek M, Henseler C, Broich K, Papazoglou A, Weiergräber M. Voltage-gated Ca⁽²⁺⁾ channel mediated Ca⁽²⁺⁾ influx in epileptogenesis. Adv Exp Med Biol. 2012; 740:1219-47.
24. Zhang L, Kolaj M, Renaud LP. Ca^2+-dependent and Na⁺-dependent K⁺ conductances contribute to a slow AHP in thalamic paraventricular nucleus neurons: a novel target for orexinreceptors. J Neurophysiol. 2010; 104(4):2052-62.
25. Marini C, Mantegazza M. Na⁺ channelopathies and epilepsy: recent advances and new perspectives. Expert Rev Clin Pharmacol. 2010;3(3):371-84.
26. Hargus NJ, Nigam A, Bertram EH , Patel MK. Evidence for a role of Nav1.6 in facilitating increases in neuronal hyperexcitability during epileptogenesis. J Neurophysiol. 2013; 110(5):1144-57.
27. Hargus NJ, Merrick EC, Nigam A, Kalmar CL, Baheti AR, Bertram EH , Patel MK.
28. Temporal lobe epilepsy induces intrinsic alterations in Na channel gating in layer II medial entorhinal cortex neurons. Neurobiol Dis. 2011; 41(2):361-76.
29. Blumenfeld H, Lampert A, Klein JP, Mission J, Chen MC, Rivera M, et al. Role of hippocampal sodium channel Nav1.6 in kindling epileptogenesis. Epilepsia.2009; 50(1): 44-55.
30. Waxman SG, Dib-Hajj S, Cummins TR, Black JA, Sodium channels and their genes: Dynamic expression in the normal nervous system, dysregulation in disease states (1). Brain Res. 2000; 886(1-2): 5-14.
31. Xu X , Guo F, Lv X, Feng R, Min D, Ma L, et al. Abnormal changes in voltage-gated sodium channels Na(V)1.1, Na(V)1.2, Na(V)1.3, Na(V)1.6 and in calmodulin/calmodulin-dependent protein kinase II, within the brains of spontaneously epileptic rats and tremor rats. Brain Res Bull. 2013; 96:1-9.
32. Guo F, Xu X, Cai J, Hu H, Sun W, He G, et al. The up-regulation of voltage-gated sodium channels subtypes coincides with an increased sodium current in hippocampal neuronal culture model. Neurochem Int. 2013; 62(3): 287-95.

Comparing the Excitability of Hippocampal Neurons in Focal and Generalized Stages of Kindling Induced Seizures in Rat

Homeira Moradi Chameh.,

Ph.D. Student of Physiology, Department of Physiology, Tarbiat Modares University of Tehran, Tehran, Iran.

Saeed Semnanian.,

Professor, Department of Physiology, Tarbiat Modares University of Tehran, Tehran, Iran.

Mahyar Janahmadi.,

Professor, Department of Physiology and Neuroscience Research Center,  Faculty of Medicine, Shaheed Beheshti Medical Sciences University, Tehran, Iran.

Amir Shojaei.,

Ph.D. Student of Physiology, Department of Physiology, Tarbiat Modares University of Tehran, Tehran, Iran.

Azam Asgari.,

Ph.D. Student of Physiology, Department of Physiology, Tarbiat Modares University of Tehran, Tehran, Iran.

Seyyed-Javad Mirnajafizadeh.,