Document Type : Original Article
Authors
1 M.Sc. Student in Biology, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Payame Noor University, Tehran, Iran
2 Medical Science Sudent, Physiology-Pharmacology Research Center, Rafsanjan University of Medical Science, Rafsanjan, Iran
3 Assistant Professor, Department of Pathology, Faculty of Medicine, Rafsanjan University of Medical Science, Rafsanjan, Iran
4 Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Basic, Payame Noor University, Tehran, Iran
5 Associate Professor, Physiology- Pharmacology Research Center, Rafsanjan University of Medical Science, Rafsanjan, Iran
Abstract
Background & Objectives: The etiology of some liver diseases is unknown, but oxidative stress has an important role in liver pathogenesis. Pistachio (Pistacia Vera) has compounds with known antioxidant properties, including coenzyme 10, vitamin E and beta-carotene. This study designed to evaluate protective effect of hydro-alcoholic extract of Pistacia Vera on liver enzymes following induction of hepatotoxicity.
Materials & methods: In this experimental study 40 male rats (200-250 g) were divided into five experimental groups. Carbon tetrachloride (CCl4) was used to induce hepatic toxicity. In normal group, no intervention was done. Vehicle group received intraperitoneal injection of 50% CCl4. Treatment groups were gavaged by three doses of Pistacia Vera hydro-alcoholic extract (10, 50 and 100 mg/kg) for 1 month. Plasma activity of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), total blood protein, plasma concentration of high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) were measured.
Results: Gavage of different doses of pistachio extract in rats poisoned by CCl4 leads to decrease in plasma activity of AST and ALT and also the plasma concentration of LDL, while the plasma activity of ALP and plasma concentration of total protein and HDL were not changed in these animals.
Conclusion: Result of this study demonstrated that chronic gavage of pistachio hydro-alcoholic extract could decrease hepatotoxicity induced by CCl4. More investigation is needed for possible clinical usage of pistachio on liver insufficiency.
Keywords
Main Subjects
مقدمه
بزرگترین ارگان بدن کبد است که اعمال مختلفی از قبیل سوختوساز مواد، سمزدایی مواد توکسیک و داروهای شیمیایی را انجام میدهد [1]. امراض کبدی سیر فزایندهای دارد و از علل میزان مرگ بالاست [2]. پاتوژنز بیماریهای کبدی کاملاً مشخص نیست، اما بیشک گونههای فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species, ROS) نقش مهمی در تغییرات پاتولوژی کبد دارد [3].
گونههای فعال اکسیژن رادیکالهای آزاد مهمی است که در میتوکندری تولید میشود. رادیکالهای آزاد اتم یا مولکولهای فعالی است که بهدلیل وضعیت آخرین لایة اتمی آنها میل ترکیبی شدیدی با سایر مولکولهای اطراف خود دارد و در صورت عدم جلوگیری از فعالیت ترکیبی آن به تخریب بافتی و بروز اختلالاتی نظیر بیمارهای قلبی و بدخیمیها میانجامد [4 و 5]. یکی از مهمترین آثار تخریبی رادیکالهای آزاد، شروع پراکسایش لیپیدهاست که موجب آسیب غشای سلول میشود. اسیدهای چرب از اجزای اصلی غشای بیولوژیکی و قالبهای ساختمانی برای اجزای مهم تشکیلدهندة غشا مانند فسفولیپیدها، گلیکولیپیدها و تریآسیل گلیسریدهاست. این رادیکالها با آلکیلهکردن گروههای پروتئینی و دیگر ماکرومولکولهای سلولی و به همان نسبت حمله به اسیدهای چرب اشباعنشده به تولید لیپید پرکسیداز میانجامد که صدمات کبدی را در پی دارد [3، 6 و 7].
دوزهای حاد مواد سمی و داروها موجب تولید مقادیر بالایی از رادیکالهای آزاد میشود که بر سیستم دفاعی آنتیاکسیدانی غلبه میکند و موجب آسیب کبدی میشود [4 و 6]. آسیب کبدی ناشی از دارو (Drug-induced liver injury; DILI) یکی از علل مهم نارسایی حاد کبدی است [8]. مسمومیت کبدی ناشی از دارو بهطور کلی به دو شکل آسیب مستقیم ناشی از دارو بهواسطة متابولیتهای آن یا با علت ناشناخته است. از چالشهای بزرگ و پیش روی صنعت دارو، بحث مسمومیت کبدی است که یکی از شایعترین عوارض داروهاست [9].
تتراکلریدکربن (Carbon tetrachloride; Ccl4) سم کبدی شناختهشدهای برای القای آسیب کبدی است [10]. این ماده توکسینی قوی و مؤثر بر کبد است که ایجاد نکروز مرکز لوبولی در کبد میکند و در مطالعات از آن برای ایجاد آسیب کبدی در مدلهای حیوانی استفاده میکنند [11].Ccl4 بهوسیلة سیتوکروم P450 به رادیکال آزاد تریکلرو متیل [Ccl3] تبدیل و موجب تحریک سلولهای کوپفر برای تولید سایر رادیکالهای آزاد میشود. این رادیکالهای آزاد باعث آسیب کبدی از طریق استرس اکسایشی میشود [12 و 13]. در سطوح بافتی، آسیب کبدی ناشی از Ccl4 با استئاتوز، نکروز و افزایش سطح آنزیمهای کبدی مشخص میشود [14].
پسته از گیاهان دارای ترکیباتی با خاصیت آنتیاکسیدانی است. نام علمی آن Pistaciavera و از گیاهان خانوادة Anacardiaceae است. مغز پسته حاوی ویتامینهای E و C، بتاکاروتن، آنتیاکسیدانهای مختلف، گاما-توکوفرول، عناصر معدنی شامل آهن، مس، سلنیم، همچنین منبعی غنی از کوآنزیم 10 است. کوآنزیم 10 در غشای داخلی میتوکندری تمام بافتها بهویژه در قلب، کبد و کلیهیافت میشود و آنتیاکسیدانی محلول در چربی است که از پراکسایش لیپیدهای غشایی جلوگیری و به تثبیت غشای سلول کمک میکند و سبب حفظ استحکام و عملکرد سلول میشود [15]. پسته دارای خاصیتهای ضددرد و ضدالتهابی [16]، محافظتکنندة کبدی [17] و مهارکنندة چربی بالا [18] است. بهدلیل ترکیبات فلاونوییدی که در برگ، دانه و صمغ پسته وجود دارد، این گیاه مورد علاقة محققان است [19]. نشان داده شده است که پسته سرشار از ترکیبات فنلی است که آنتیاکسیدانهای قوی محسوب میشود [20].
تاکنون پژوهشهایی روی آثار آنتیاکسیدانی عصارة گیاهان متعددی از جمله عدس قرمز و کلالة زعفران، در درمان مسمومیت کبدی انجام شده است که نتایج قابلتوجهی در کاهش عوارض کبدی داشته است [21 و 22]. با توجه به اهمیت کبد بهعنوان نگهبان محیط داخلی بدن و اعمال منحصربهفرد آن، بهنظر میرسد تحقیق روی موادی اهمیت دارد که باعث حفاظت کبد میشود. لذا، در این مطالعه به بررسی اثر عصارة هیدروالکلی پسته بر میزان فعالیت آنزیمهای کبدی متعاقب القای مسمومیت کبدی پرداختهایم.
مواد و روشها
این مطالعه از نوع تجربی است که در سال 1394 انجام شد. تعداد 40 سرموش صحرایی نر نژاد ویستار از لانة حیوانات گروه فیزیولوژی دانشکدة پزشکی رفسنجان با میانگین وزنی 30±220 گرم جامعة آماری انتخاب شد. حیوانات در دمای °C 25، چرخة 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و در شرایط مناسب از نظر تغذیه و آب نگهداری میشد. تمام این مراحل پس از به تصویب رسیدن و تأیید کمیتة اخلاقی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان و با کد اخلاق IR.RUMS.REC.1394.64 انجام گرفت.
برای عصارهگیری از پستة اکبری با کد ژنتیکی M30 و با تأیید گونة آن در هرباریوم مرکز تحقیقات پستة رفسنجان استفاده شد. سیصد گرم پودر پستة خردشده با 900 میلیلیتر اتانول 80 درصد مخلوط و در انکوباتوری با دمای °C 50 برای مدت دوازده ساعت نگهداری و پسماندههای مخلوط برای سه بار به همین صورت عصارهگیری شد. عصارههای بهدستآمده با هم مخلوط و با دستگاه Rotary evaporator (مدل SB1100 ساخت شرکت Eyela کشور ژاپن) حلال آن جدا شد. برای استفاده، عصارة گیاه در دیمتیل سولفواکساید (DMSO) 5/2 درصد و آب مقطر به نسبت 1:9 حل و با دوزهای 50، 10 و 100 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم به حیوانات گاواژ شد [10].
تتراکلریدکربن 50 درصد از شرکت Merck آلمان تهیه شد. حیوانات تتراکلریدکربن 50 درصد (به نسبت 1:1 رقیقشده با روغن زیتون) را به میزان 1 میلیلیتر بر کیلوگرم وزن بدن دو بار در هفتة نخست بهصورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند [10].
پس از طی دورة سازگاری، حیوانات بهطور تصادفی به پنج گروه هشتتایی تقسیم و به شرح زیر تیمار شدند: گروه 1 (گروه سالم) شامل موشهای سالم که هیچ دارویی دریافت نکردند. گروه 2 (گروه حلال) که به میزان 1 میلیلیتر به ازای هر کیلوگرم وزن بدن تتراکلریدکربن 50 درصد (رقیقشده درروغن زیتون) را دو بار فقط در هفتة نخست دریافت کردند. گروههای 3، 4 و 5 که علاوه بر دریافت تتراکلریدکربن (در روشی مشابه با گروه حلال) تحت گاواژ روزانة عصارة هیدروالکلی پسته با دوزهای 10، 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن، به مدت 28 روز قرارگرفتند [23].
چهلوهشت ساعت پس از آخرین تیمار، خونگیری از گوشة چشم موشها انجام گرفت. برای خونگیری، نخست موشها بهصورت جداگانه و دور از دید سایر موشها با محفظهای به آزمایشگاه آورده میشد. بعد با تزریق داخل صفاقی مخلوط (1 به 9) زایلازین 1 درصد و کتامین حیوانی در هر کیلوگرم بدن حیوان، بیهوش شدند. سپس، با لولة هماتوکریت هپارینه که به دو قسمت تبدیل شده بود از مسیر گوشة چشم آنها از ورید پشتکاسة چشم (رترواوربیتال) خونگیری انجام شد [24]. سرم خون جمعآوریشده با سانتریفوژ مدل 5430 (شرکت Eppendorf، کشور آلمان) با دور 3000 بار در دقیقه بهمدت 5 دقیقه جدا شد و فعالیت آمینو ترانسفرازهای سرمی شامل آلانین آمینو ترانسفراز (Alanine Aminotransferase; ALT)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (Aspartate Aminotransferase; AST)، همچنین آلکالین فسفاتاز (Alkaline Phosphatase; ALP)، پروتئین تام، لیپوپروتئینهای با چگالی کم (Low-density lipoprotein; LDL) و چگالی زیاد (High-density lipoprotein; HDL) با کیتهای تجاری شرکت پارس آزمون در آزمایشگاه دانشکدة پزشکی با دستگاه BT3000 اتوآنالیزر (مدل BT3000 ساخت شرکت Technicon کشور فرانسه) اندازهگیری شد [25].
دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخة 18 تجزیهوتحلیل شد. نتایج بهصورت انحراف معیار±میانگین گزارش شده است. با توجه به اینکه دادهها توزیع نرمال داشت (Shapiro-Wilk all P>0.0)، اختلاف بین گروهها با آزمون آنالیز واریانس یکطرفه بررسی شد. همچنین، برای مقایسة زوجی بین گروهها از پسآزمون Dunnett T3 استفاده شد. سطح معنادار در آزمونها 05/0 در نظر گرفته شد.
یافتهها
مقایسة میزان فعالیت پلاسمایی آنزیمهای ALT AST (شکل 1 و 2)، همچنین غلظت پلاسمایی LDL (شکل 3) بین گروه نرمال با گروه Ccl4 نشان داد که شاخصهای فوق متعاقب القای مسمومیت کبدی با Ccl4 افزایش معناداری را نشان میدهد (05/0ANOVA followed by Dunnett T3 all P<) اما، در میزان فعالیت آنزیم ALP (شکل 4)، همچنین غلظت پلاسمایی HDL (شکل 5) و غلظت پلاسمایی پروتئین تام (شکل 6) بین دو گروه نرمال و گروه Ccl4 تفاوت معناداری مشاهده نشد (05/0ANOVA all P<).
نتایج مربوط به اثر گاواژ عصارة پسته بر شاخصهای مورد ارزیابی، در نمودار 6 نمایش داده شده است. بررسی آماری نشان داد که گاواژ دوزهای 10، 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم عصارة هیدروالکلی پسته به حیوانات دچار مسمومیت کبدی با Ccl4، باعث کاهش معنادار میزان فعالیت پلاسمایی آنزیمهای ALTAST (شکل 2 و 1)، همچنین غلظت پلاسمایی LDL (شکل 3) شد (05/0ANOVA all P<0.05 followed by Dunnett T3 all P<). بههرحال، در میزان فعالیت آنزیم ALP (شکل 4)، همچنین غلظت پلاسمایی HDL (شکل 5) و غلضت پلاسمایی پروتئین تام (شکل 6) بین گروههای دریافتکنندة دوزهای مختلف عصاره و گروه Ccl4 تفاوت معناداری مشاهده نشد (05/0ANOVA all P>).
بحث
نتایج این مطالعه نشان داد که گاواژ عصارة پسته باعث بهبود مسمومیت کبدی القاشده بهوسیلة Ccl4 از طریق بهبود شاخصهای عملکردی کبد شامل ALT، AST و LDLمیشود.
القای مسمومیت با تزریق تتراکلرید کربن باعث افزایش معنادار فعالیت آنزیمهای ALT و AST و غلظت پلاسمایی LDL در مقایسه با گروه نرمال شد. در مطالعات قبلی، این افزایش در سطحهای آنزیمهای ALT و AST بهدنبال القای مسمومیت با Ccl4 در موش صحرایی گزارش شده است [26] که با نتایج مطالعة حاضر همخوانی دارد. Ccl4 در واقع، پس از متابولیزهشدن با سیتوکروم P450 تولید رادیکالهای آزاد میکند. این رادیکالهای آزاد باعث پراکسایش لیپیدهای غشایی و ازبینرفتن تمامیت آن و در نتیجه ایجاد نکروز میشود و آنزیمهای کبدی به خارج سلول راه مییابد.
شکل 1. مقایسة فعالیت پلاسمایی آنزیم آلانین آمینوترانسفراز (ALT) در گروههای مختلف مورد مطالعه
شکل 2. مقایسة فعالیت پلاسمایی آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) در گروههای مختلف مورد مطالعه
شکل 3. مقایسة غلظت پلاسمایی لیپوپروتیینهای با چگالی کم (LDL) در گروههای مختلف مورد مطالعه
شکل 4. مقایسة فعالیت پلاسمایی آنزیم آلکالین آمینوترانسفراز (ALP) در گروههای مختلف مورد مطالعه
شکل 5. مقایسة غلظت پلاسمایی لیپوپروتئینهای با چگالی زیاد (HDL) در گروههای مختلف مورد مطالعه
شکل 6. مقایسة غلظت پلاسمایی پروتئین تام خون در گروههای مختلف مورد مطالعه
در مطالعهای میزان پراکسایش لیپیدها در کبد موشها بررسی شد [21]. نتیجة این تحقیق نشاندهندة افزایش معنادار میزان پراکسایش لیپیدی متعاقب تجویز تتراکلرید کربن نسبت به گروه کنترل بود که در نتیجه سطح مالون دیآلدهید بهعنوان مارکر پراکسایش لیپیدها از جمله LDL بود.
تجویز عصارة پسته به حیوانات دچار مسمومیت کبدی با Ccl4، از افزایش سطوح آنزیمهای کبدی جلوگیری کرد که این اثر در مورد دوز 50 میلیگرم بر کیلوگرم آشکارتر بود. علاوهبر آن، غلظت پلاسمایی LDL نیز متعاقب گاواژ عصاره کاهش نشان داد. در مطالعات گذشته روی عصارههایی گیاهان دیگر نیز آثار قابلتوجهی در کاهش آسیب کبدی بهدنبال القای مسمومیت نشان داده شده است. از جملة این موارد میتوان به گیاه کاسنی اشاره کرد که در پژوهشی عصارة پلیفنولی آن توانست میزان آنزیمهای AST و ALT را در موشهای مسموم شده با تیواستامید کاهش دهد [27]. همچنین، در مطالعهای، اثری مشابه در مورد عصارة میوة زرشک بر مسمومیت کبدی القاشده با تتراکلریدکربن گزارش شده است [28] که با نتایج مطالعة حاضر همخوانی دارد. در پژوهشی دیگر، اثر محافظتی عصارة هیدروالکلی صمغ پسته در موش صحرایی بررسی شد. در این مطالعه، تجویز عصارة صمغ، ALT را کاهش داد، اما تغییری در سطح AST ایجاد نکرد. در مطالعة حاضر، عصارة مغز پسته بهطور کامل مانع از افزایش سطوح ALT و AST شد. شاید علت این امر در تفاوت ترکیبات صمغ و خود پسته است [29].
مطالعات فیتوشیمیایی حضور ترکیبات باارزش زیادی را در مغز پسته نشان داد، ازجمله ویتامینهایC و E، بتاکاروتن، آنتیاکسیدانهای مختلف، عناصر معدنی شامل آهن، مس، سلنیم و کوآنزیم 10 [15]. دانة پسته جزو پنجاه غذایی است که بیشترین خواص آنتیاکسیدانی را دارد [30]. توماینو و همکاران در بررسی ترکیبات فنولی پسته نشان دادند که ترکیبات فنولی مانند gallic acid، cyanidin-3-O-galactoside، eriodictyol-7-O-glucoside، catechin و epicatechin بیشترین آثار آنتیاکسیدانی را دارد [30].
فلاونوئیدها، آنتوسیانینها و تاننها از ترکیبات فنلی و جز متابولیتهای ثانویه است که نقش دفاعی در گیاهان بهعهده دارد. آغازگر مسیر ساخت این ترکیبات، آنزیمی به نام فنیل آلانین آمینولیاز (PAL) است [31 و 32]. ترکیبات فلاونوئیدی با مهار پراکسایش لیپیدی باعث حفظ تمامیت غشای سلولها و در نتیجه جلوگیری از نشت آنزیمها به خارج سلولها و مانع ایجاد نکروز میشود [33 و 34]. علاوهبر آن، گزارش شده است که ترکیبات فنلی قادر به کاهش محتوای لیپیدهای پلاسما بهغیر از HDL است [35].
قابلذکر است در پژوهش حاضر تغییر معناداری در سطوح پروتئین تام، ALP وHDL در هیچیک از گروهها دیده نشد. این امر ممکن است ناشی از سازوکار اثر متفاوت ترکیبات پسته، همچنین Ccl4 باشد. برای بررسی این موضوع مطالعات بیشتری لازم است. علاوهبر آن، شرایط دمایی که در آن عصارهگیری انجام شده است، ممکن است بر ترکیبات پسته اثر گذاشته باشد. لذا، پیشنهاد میشود برای بهدستآوردن نتایج بهتر و مشخصکردن تأثیر دقیق ترکیبات موجود در عصارة پسته، مواد مختلف موجود در این گیاه با انجام کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استخراج و استفاده شود.
نتیجهگیری
یافتههای این پژوهش نشان داد القای مسمومیت کبدی باعث افزایش سطح سرمی آنزیمهای ALT و AST و تجویز 28 روزة عصارة پسته به موشهای مسموم، سبب کاهش فعالیت سرمی آنزیمهای ALT و AST میشود. بهنظر میرسد که دوز 50 میلیگرم عصاره بهترین پاسخ اثربخشی را داشته است، ضمن آنکه تجویز این عصاره در این مدت، سبب عوارض نامطلوب کبدی نشد. بنابراین، با کمک مطالعات آینده ممکن است کاربرد درمانی پسته حداقل بهعنوان درمان مکمل برای نارساییهای کبدی پیشنهاد شود.
تشکر و قدردانی
از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان برای حمایت مالی از این طرح و از مرکز تحقیقات فیزیولوژی-فارماکولوژی در فراهمسازی بستر انجام این مطالعه، همچنین از جناب آقای دکتر معین کاردوست که صمیمانه ما را در انجام این مطالعه یاری کردند، سپاسگزاریم.