Document Type : Original Article
Authors
Abstract
Background: Anthrax is a common illness between human and animal which the agent of that is Bacillus anthracis. The modified protective antigen cab be used in treatment and vaccination. The aim of this study is the recombinant expression of modified protective antigen in E. coli.
Material and Methods: Gene fragments were amplified with PCR from pXOI and fusion gene from SOEing PCR was cloned in a cloning vector and finally sub cloned in pET28a(+) vector and transferred to E. coli BL21(DE3) competent cells. Recombinant expression of modified PA was induced by IPTG and after protein purification with affinity chromatography, resulted antigen was injected to mice in 4 repeats. Polyclonal antibodies produced in mice serum was accessed.
Results: The modified protective antigen cloned in expression vector pET28a(+) was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. Recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and western blot. Serum was separated from mice blood and titre of antibody against modified PA was assessed by indirect ELYSA.
Conclusion: resulted protein has high inhibitory property for LF and EF virulence factors. By consideration in PA detection by polyclonal antibody against modified PA from Bacillus anthracis, it can be used in for treatment and prophylaxis against anthrax in individual or combination forms with other PA domains.
Keywords
مقاله اصیل |
همسانه سازی و بیان آنتیژن حفاظتی تغییریافته باسیلوسآنتراسیس در باکتری E. coli
سید مسیح اعتماد ایوبی1، حسین هنری2
1 دانشجوی دکتری نانوبیوتکنولوژی، مرکز و گروه علوم زیستی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران.
2 دانشیار گروه علوم زیستی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران.
* نشانی نویسنده مسئول: تهران، دانشگاه امام حسین (ع)، گروه علوم زیستی، حسین هنری
E-mail: honari.hosein@gmail.com
وصول:12/8/94، اصلاح:2/10/94، پذیرش:11/11/94
چکیده
زمینه و هدف: سیاهزخم یک بیماری مشترک بین انسان و دام است. عامل این بیماری باکتری باسیلوس آنتراسیس میباشد. آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته باسیلوس آنتراسیس برای درمان و واکسن قابل استفاده می باشد. هدف این مطالعه بیان آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته باسیلوس آنتراسیس در باکتریE. coli میباشد.
مواد و روش ها: قطعات ژنی مورد نظر از پلاسمید pXOI تکثیر و با عمل SOEiong PCR قطعه بدست آمده در کلونینگ وکتور همسانهسازی گردید و بعد از جداسازی به وکتور pET28a(+) زیرهمسانهسازی و به باکتری E.coli سویه BL21(DE3) تراریخت شد. بیان آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته باسیلوس آنتراسیس تحت القایIPTG انجام و بعد از تخلیص پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی، آنتیژن حاصل در چهار نوبت به موشهای سوری تزریق شد. آنتیبادی پلیکلونال تولید شده در سرم موشها اندازهگیری گردید.
یافته ها: آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته باسیلوس آنتراسیس کلون شده در وکتور بیانی pET28a(+) به وسیلهی PCR، آنالیز آنزیمی و توالی یابی تأیید گردید. پروتئین نوترکیب تولید شده به وسیله SDS-PAGE و لکهگذاری وسترن تایید شد. سرم از خون موش جداسازی شد و تیتر آنتی بادی علیه PA تغییر یافته از طریق الایزای غیر مستقیم ارزیابی گردید.
نتیجه گیری: پروتئین تولیدی دارای خاصیت مهار کنندگی بالایی برای فاکتورهای بیماریزای LF و EF می باشد. با توجه به شناسایی آنتی ژن PA بوسیله آنتی بادی آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته باسیلوس آنتراسیس، میتوان بهصورت مجزا، یا ترکیبی با سایر دومن های PA در طراحی واکسن و بعنوان دارو برای درمان و پیشگیری بیماری سیاهزخم استفاده نمود.
کلید واژه: آنتی ژن حفاظتی تغییر یافته، باسیلوس آنتراسیس، پروتئین نوترکیب.
مقدمه
سیاهزخم (Anthrax) یک بیماری مشترک بین انسان و دام است که به وسیله باکتری باسیلوسآنتراسیس (Bacillus anthracis)ایجاد میشود(2،1). باکتری باسیلوسآنتراسیس یکی از بزرگترین و مهمترین عوامل بیولوژیک به شمار میرود و پتانسیل استفاده در جنگهای بیولوژیک را دارا هست(1). باسیلوسآنتراسیس علاوه بر یک DNA حلقوی بهاندازه 5/4 مگاباز، دارای دو پلاسمید بزرگ pXO1 (شامل ژنهای توکسیک) و pXO2 (شامل ژنهای مولد کپسول) هست. توکسین با واسطه یک پلاسمید به نام PBA1 یا pXO1 ایجاد میشود که 3 پروتئین یا فاکتور مولد ادم (EdemaFactor)(EF)، آنتیژن محافظتکننده (PA) (protective antigen) و فاکتور مولد مرگ سلولی (LethalFactor)(LF) را کد میکند (4،3). پروتئین ژن PA بهطور اختصاصی به گیرندههای سطح سلول میچسبد. سپس PA توسط پروتئازهای شبیه به فورین شکسته میشود و دو قطعه PA20 و PA63 ایجاد میگردد که قطعه PA63 در سطح سلول باقیمانده و برای اتصال LF و EF آمادهشده و تشکیل ساختار هپتامری، ایجاد منفذ و ترانسلوکاسیون به داخل سلول انجام میگیرد(5). آنتیژن محافظتکننده (PA) کامل و فاقد قطعه 20 کیلودالتونی (بعد از ورود آنتیژن محافظتکننده (PA) کامل با طول 63 کیلودالتون به داخل بدن، یک قطعه 20 کیلودالتونی از آن جدا میشود و قطعهای به طول 63 کیلودالتون باقی میماند) با یک و یا دو اسیدآمینه تغییریافته در نواحی 427 یا 396 و 425 دارای خاصیت مهارکنندگی برای فاکتورهای بیماریزایLF و EF هست(6،3). امروزه سیستمهای بیانی بسیار متنوعی وجود دارد و در اشل صنعتی از باکتری، مخمر، گیاه، سلول حیوانی استفاده میشود. با توجه به کاربردی بودن این سیستم در آزمایشگاهها و کمهزینه بودن آن، در این پژوهش از سیستم بیانی باکتری استفادهشده است. در ادامه به منظور تولید کاندید واکسن و داروی نوترکیب، آنتیژن محافظتکننده (PA) 63 کیلو دالتونی با یک اسیدآمینه تغییریافته باسیلوس آنتراسیس (mPA) همسانهسازی، بیان و تولید آنتیبادی پلیکلونال در موش سوری انجام شد تا در آینده نقش آن در طراحی واکسن یا دارو با سایر دومنهایLF، EF و PAمورد مطالعه قرار گیرد.
مواد و روشها
طراحی پرایمر برای آنتیژن حفاظتی مربوط به باکتری باسیلوس آنتراسیس: توالی کامل ژن PA باکتری باسیلوسآنتراسیس از بانک ژن (NBCI با شماره Accession No: M29081) استخراج و طراحی پرایمرها انجام و توسط شرکت سینا ژن سنتز شد.
توالی پرایمر رفت با جایگاه شناسایی آنزیم محدودالاثر BamHI (فرمنتاز):
For5' GAGGATCCACAAGTGCTGGACCTACGGT3'
For5' AATGCACAAGACGATGGCAGTTCTACTCCAATTACAATGA3' SOEing PCR
توالی پرایمر برگشت با جایگاه شناسایی آنزیم محدودالاثرXhoI (فرمنتاز):
Rev5'CTGGCATCGTCTTGTGCATTTAATGC3' SOEing PCR
Rev5'GGCTCGAGTTATCCTATCTCATAGCCTTTT3'
تکثیر قطعات ژن PA با واکنش PCR: باکتری باسیلوسآنتراسیس از بخش هوازی موسسه رازی تهیه شد. پلاسمیدهای باکتری با استفاده از روش فنل-کلروفرم استخراج و بهعنوان الگو در واکنش PCRاستفاده شد. واکنش PCR برای تکثیر قطعات ژنPA ابتدا با آنزیم Taqپلیمراز(سینا ژن) بهینهسازی شد. بهمنظور جلوگیری از موتاسیونهای ناخواسته تکثیر نهایی ژن با استفاده از آنزیم Pfu پلیمراز(فرمنتاز) صورت گرفت. با عمل SOEing PCR دو قطعه به یک قطعه تبدیل شد (7،3،1).
همساسازی و زیرهمسانهسازی) قطعه حاصل از (PCR به وکتورها: محصول PCRبه کمک مارکر اسیدنوکلئیک (#SM0313)(فرمنتاز) روی ژل آگارز(مرک) بررسی و سپس از روی ژل تخلیص و به انتهای آنها نوکلئوتید A اضافهشد. برای همسانهسازی و تراریختکردن از وکتور pEGM-T Easy Vector (Promega) و سلولهای مستعد E. coli سویهDH5α(نوا ژن) استفاده شد. سپس قطعات توسط آنزیمهای محدودالاثر BamHI و XhoIاز ناقل TA کلونینگ جداسازی و در وکتور بیانی pET28a(+)(کیاژن) زیرهمسانهسازی و در سلولهای مستعد E. coli سویهBL21(DE3)(stratagen) تراریخت و قطعه ژنی به وسیلهPCR، آنزیم برشی و تعیین توالی تاییدشد(7،3).
بیان ژن موردنظر: بیان ژن مورد نظرتوسط القاء کننده پروموتر (IPTG)(فرمنتاز) با غلظت 1 میلیمولار و به مدت 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انجامشد(8،3).
الکتروفورز SDS-PAGE: نمونههای قبل و بعد از القای IPTG، همراه با مارکر پروتئینی#PR0602-S (Vivantis) تحت شرایط دناتوره، الکتروفورز شدند. غلظت ژل 15 درصد با جریان ثابت 25 میلیآمپر بود(9).
تخلیص با ستون نیکل: پروتئین حاصل تحت شرایط دناتوره و با استفاده از ستونNi-NTA (کیا ژن) جداسازی وتخلیص شد.
تولید آنتیبادی علیه PA: پروتئین PA در چهار نوبت، به میزان µg20 بار اول همراه با ادجوانت کامل(رازی) و در نوبتهای بعدی µg 15 با ادجوانت ناقص فروند به موش سوری تزریق و در نهایت از موشها خونگیری و توسط آزمایش الایزا تیتر آنتیبادی آن اندازهگیری شد.
تأیید پروتئین نوترکیب با روش وسترن بلات: برای تأیید پروتئین نوترکیب بیانشده از تکنیک ایمونوبلات با آنتیبادی پلیکلونال ضد PAکامل(تولیدی دانشگاه جامع امام حسین (ع))استفاده شد(10،9).
ارزیابی تیتر آنتیبادی ضد پروتئین نوترکیب به روش الایزای غیرمستقیم: مقدار 20 میکروگرم از پروتئین نوترکیب PA در چهار نوبت، به موشهای سوری تزریق و درنهایت از آنها خونگیری و توسط آزمایش الایزا غیرمستقیم تیتر آنتیبادی اندازهگیری شد(10،3).
یافتهها
تکثیر ژن PA: پس از تکثیر ژن تغییریافته PA به روش PCR، محصول روی ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 1) و قطعه موردنظر از لحاظ اندازه با ژن هدف همخوانی داشت (1716 جفت باز).
تأیید همسانهسازی ژن هدف در وکتور pEGM-T Easy Vector: پس از تخلیص پلاسمید و تأیید آنها روی ژل آگارز، برای تأیید بیشتر از پلاسمیدها بهعنوان الگو در واکنش PCRاستفاده گردید، از طرفی با دو آنزیم BamHI و XhoIهضم شدند سپس به کمک مار کر اسید نوکلئیک، اندازه قطعه خارجشده از وکتورتأیید شد(شکل 2).
تأیید همسانهسازی ژن هدف در وکتور بیانی pET28a(+): پس از تخلیص پلاسمید و تأیید آنها روی ژل آگارز، برای تأیید بیشتر از پلاسمیدها بهعنوان الگو در واکنش PCRاستفاده گردید، از طرفی با دو آنزیم BamHI و XhoIهضم گردیدند. سپس به کمک مار کر اسید نوکلئیک، اندازه قطعه خارجشده از وکتور (1716 جفت باز) تأییدگردید(شکل 3).
بیان ژن در وکتور pET28a(+): در این مرحله پس از کشت سلولها و القا با IPTG بیان ژن صورت پذیرفت و پس از تیمار خام بر روی ژل SDS-PAGEو به کمک مارکر پروتئینی موردبررسی قرار گرفت. با توجه به وزن پروتئین نوترکیب (kDa 63) از ژل 15 درصد استفاده شد(شکل 4).
پس از این که از القاء بیان ژن اطمینان حاصل شد، بیان با کشت کلونها در محیط LB مایع حاوی μg/ml40 کانامایسین، پس از رسیدن OD محیط کشت به 6/0 درطول موج 600 نانومتر، با افزودن IPTG با غلظت mM1 به محیط و انکوبه نمودن آن در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکر دار با سرعت rpm150 به مدت 5 ساعت به دست آمد.
تأیید محصول پروتئینی به دست آمده با تکنیک Western Blotting: بهمنظور تأیید محصول پروتئینی از تکنیک Western Blotting استفاده شد. در این روش از
|
بررسی تولید آنتیبادیIgG علیه آنتیژن PA در موش سوری:
روش الایزا برای تعیین تیتر آنتیبادی علیه پروتئین نوترکیب بهمنظور ارزیابی محصول در طول فرایند تخلیص و همچنین تعیین تیتر خنثیسازی در سرم حیوانات ایمن شده مورداستفاده قرار گرفت. نمودار زیر بیانگر تیتر سرم در حیوانات مورد استفاده است.
بررسی نمودار فوق، نتایج حاصل از آزمایش الایزا با پروتئین نوترکیب را نشان میدهد که پس از تزریق افزایش تیتر آنتیبادی در مقایسه با کنترل قابلتوجه است. بالاترین ODبهدستآمده از تست در مقایسه با کنترل تفاوت فراوانی دارد. نتایج نشان داده که این پروتئین قدرت تولید آنتیبادی به میزان لازم را داشته و تولید آنتیبادی در حیوان با ایمنیزایی همبستگی مثبت دارد.
بحث
برای مقابله با سیاهزخم سه راه وجود دارد، واکسیناسیون برای پیشگیری در مرحله اول، آنتیبیوتیکها برای درمان عفونت و درمانهای ضد سم برای جلوگیری از اثرات سمی باکتری در اواخر مرحله عفونت(11). تنها اجزا پروتئینهای سمی باسیلوس آنتراسیس دارای خاصیت آنتی ژنیک بسیار قوی بوده که زیر واحد PAبه عنوان کاندید اصلی واکسن این عامل مطرح هست و ایمنی حمایتی، علیه بیماری ایجاد میکنند. این ایمنی درنتیجه خنثیسازی فعالیت توکسین آنتراکس اتفاق میافتد (12،6). PA یک جزء بسیار مهم از توکسین آنتراکس است. این پروتئین در ایمنی علیه آنتراکس نقش اصلی را هم بعد از ایمنسازی و هم در جریان عفونت بازی میکند و دارای خاصیت مهارکنندگی برای فاکتورهای بیماریزایLF و EF هست(6،3). با توجه به نقش آن، PA بهطور گستردهای به عنوان یکی از کاندیدهای واکسن مورد مطالعه قرارگرفته است(14،13،12). برای مطالعه خصوصیات یک آنتیژن بهعنوان واکسن ضرورت دارد که پروتئین نوترکیب در یکی از میزبانها تولید شود. یکی از میزبانهای کمهزینه برای تولید پروتئینهای نوترکیب باکتری اکولای هست که در آزمایشگاه مرکز زیستشناسی دانشگاه جامع امام حسین(ع) از این میزبان بهوفور استفاده میشود. نتایج به دستآمده نشان میدهد که این ژن در وکتور PET28 بیان بسیار بالایی را از خود نشان داده است. آنتیژن PA تغییریافته به عنوان دارو برای باسیلوس آنتراسیس مطرح بوده که پروتئین نوترکیب آن در میزبان اکولای با موفقیت تولیدشده است.
نمودار 1: بررسی تیتر آنتیبادی IgG تولیدشده درموش سوری علیه آنتیژن 63PA بر پایه اجوانت فروند
|
موتاسیون هایی که عملکرد انتقال PA را مهار میکنند یا از طریق اختلال در انتقال توکسین و یا در باز آرایی کانفورماسیونی دومن دو برای تشکیل منفذ، اثرگذار هستند. دو کلاس از این موتاسیونها در دومن دوطبقه بندی شدهاند: آنهایی که تبدیل پیش منفذ به منفذ را بلوکه میکنند و آنهایی که اجازه تشکیل منفذ را میدهند ولی توانایی منفذ در ترانسلوکاسیون را از بین میبرند(8). از این ویژگی میتوان بهعنوان دارو برای به دام اندازی سم باکتری سیاهزخم استفاده کرد. با توجه به نتایج پژوهش مااین عملکرد در پژوهشهای آینده میتواند موردبررسی قرار گیرد. اسیدآمینه 427 PA که فنیل آلانین است نقش زیادی در انتقال PA دارد، زیرا هم برای تشکیل منفذ و انتقال پروتئین مهم است. از طرفی ثابتشده است برخی از موتاسیون های اسیدآمینه 427 در داخل بدن دارای فعالیتهای درمانی میباشند(17).
در موش موتاسیون فنیل آلانین موقعیت 427 به آسپارتیک اسید اثرات مهاری قویتری از موتاسیون فنیل آلانین به آسپارژین نشان میدهد؛ بنابراین، میتوان از پتانسیل درمانیPA موتاسیون یافته برای درمان آنتراکس درصورتیکه زود و قبل از ورود باکتری به بدن و یا در مراحل اولیه عفونت که تعداد باکتری کم است و ترشح سم به میزان کم است تزریق شود. در این حالت میتوان از PA موتاسیون یافته بهعنوان دارو برای درمان استفاده کرد(18). از آنجاییکه ارتباط مثبتی بین موتاسیون اسیدآمینه فنیل آلانین 427 بر روی سمیت سلولی وجود دارد. این اثر درنتیجه ایجاد اختلال در تشکیل منفذ و فرایند عبور از غشا رخ میدهد (20،19). موتاسیون یافتههایF427W، F427L وF427Y در واسطهگری در سمیت سلولی بسیار فعال هستند و موجب انتقال مؤثر در سرتاسر غشا به داخل سیتوزول سلولهای مدل میشود. موتاسیون یافتههایF427G ، F427R و F427D باعث اختلال در تشکیل منفذ میشوند که این اثر با توجه به تواناییشان متفاوت است(18). در مثالهای زیر تأثیر انواع موتاسیون یافتههای اسیدآمینه فنیل آلانین 427 در سمیت سلولی و درصد تشکیل منفذ مشخصشده است. در مورد موتاسیون یافتههای F427S، F427T و F427H تشکیل منفذ 100 درصد میباشد و سمیت سلولی مشاهده نشده، در حالت F427D تشکیل منفذ 25 در صد است و سمیت سلولی نیز ایجاد نمیشود و اما در مورد موتاسیون یافته F427G که مورد توجه و استفاده در این پژوهش نیز است منفذی تشکیل نمیشود و سمیت سلولی نیز ایجاد نمیشود(19).
تغییریافتگی اسیدآمینه 427 ژن PA به گلایسین باعث میشود که عمل انتقال صورت نگیرد و حبس EF یا LF در داخل هپتامر یا اکتامر انجام گیرد. از این ویژگی میتوان برای ساخت یک دارو علیه سیاهزخم استفاده کرد(20،19). بر اساس نتایج این پژوهش نقش آنتیژن حفاظتی تغییریافته PA63 در ایجاد آنتیبادی علیه آن به اثبات رسید. با توجه به نتایج بهدستآمده از این تحقیق و بررسی مطالعات انجامشده این پروتئین را میتوان بهعنوان یک ایمونوژن برای طراحی یک واکسن و داروی مهندسیشده نوترکیب پیشنهاد نمود.
تشکر و قدردانی
در پایان از زحمات اساتید، پژوهشگران محترم مرکز و گروه علوم زیستی، دانشگاه جامع امام حسین(ع) تهران که در به نتیجه رسیدن این پژوهش ما را حمایت معنوی و مالی نمودند سپاسگزاری میشود.
References
- Ahmadi AH, Honari H, EbrahimMinaei M. Cloning, fusion and expression of domain a-1 protective antigen (PA20) of Bacillus anthracis and N-Terminal ipaD gene of Shigella in E. coli. Qom Univ Med Sci 2015; 9(4): 20-29. (Persian)
- Koehler TM. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol Aspects Med. 2009; 30(6): 386-396.
- Honari H, Mehrazin H, Saadati M, Minaie ME. Production of polycolonal antibody against domain 2-4 of protective antigen of Bacillus anthracis in laboratory animal. J ShahrekordUni Med Sci 2014; 15(6): 35-43. (Persian)
- Bragg TS, Robertson DL. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lef) from Bacillus anthracis. Gene. 1989; 81(1): 45-54.
- Benson E, Huynh P, Finklestein A, Collier R. Identification of residues lining the anthrax protective antigen channel. Biochemistry. 1998; 37(11): 3941-8.
- Turnbull Panthrax vaccines: past, present and future. Vaccine. 1991; 9: 533-539.
- Abboud N, Casadevall A. Immunogenicity of Bacillus anthracis Protective Antigen Domains and Efficacy of Elicited Antibody Responses Depend on Host Genetic Background. Clinical and vaccine immunology, 2008; p: 1115–1123.
- P13423(PAG_BACAN), Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot. [Last modified October 5, 2010; Version 109].
- Honari H, Baranvand M, EbrahimMinaei M. Immunogenicity Investigation of recombinant proteins (StxB) of Shigelladysenteriae type 1 in mice. Quarterly J of SabzevarUni of Med Sci. 2015; 21(6):1111. (Persian)
- Little SF, Webster WM, Norris SLW, Andrews GP. Evaluation of an anti-rPAIgG ELISA for measuring the antibody response in mice. Biologicals. 2004; 32(2): 62-9.
- Friedlander A. M. Tackling anthrax. Nature. 2001; 414:160–161.
- Singh, Y. B. E. Ivins, and S. H. Leppla. Study of immunization against anthrax with the purified recombinant protective antigen of Bacillus anthracis. Infect Immun. 1998; 66:3447–3448.
- Grabenstein J D. Vaccines: countering antrax: vaccines and immunoglobulins. Clin Infect Dis. 2008; 46:129–136.
- Sloat, B. R. and Z. Cui. Nasal immunization with anthrax protective antigen protein adjuvanted with polyriboinosinic-polyribocytidylic acid induced strong mucosal and systemic immunities. Pharm Res. 2006; 23:1217–1226.
- Pezard C, Sirard JC and Mock M. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin mutant strains. AdvExp Med Biol. 1996; 397: 69–72.
- Ivins B,Welkos S.Recent advances in the development of an improved human anthrax vaccine. Eur J Epidemiol. 1988; 4(1): 12-9.
- Mourez, M. M. Yan, D. B. Lacy, L. Dillon, L. Bentsen, A. Marpoe, C. Maurin, E. Hotze, D. Wigelsworth, R. A. Pimental, J. D. Ballard, R. J. Collier, and R. K. Tweten. Mapping dominant-negative mutations of anthrax protective antigen by scanning mutagenesis. ProcNatlAcadSci USA. 2003; 100:13803–13808.
- Yan M, Roehrl M H, Basar E, Wang J Y. Selection and evaluation of the immunogenicity of protective antigen mutants as anthrax vaccine candidates. Vaccine. 2008; 26: 947–955.
- Sun J, E Lang A, Aktories K, Collier R J. Phenylalanine-427 of anthrax protective antigen functions in both pore formation and protein translocation. 2008; 105(11): 4346-4351.
- Cao S, Guo A, Liu Z, Tan Y, Wu G, Zhang Ch, Zhao Y, Chen H. Investigation of New Dominant-Negative Inhibitors of Anthrax Protective Antigen Mutants for Use in Therapy and Vaccination. American Society for Microbiology. 2009; 77(10): 4679–4687.
Original Article |
Seyed Masih E'temad Aubi
PhD Student of nanobiotechnology, Department of Biology, Biology Research Center, Imam Hosein University, Tehran
*Hossein Honari
PhD in molecular genetics, Department of Biology, Biology Research Center, Imam Hosein University, Tehran
Received:03/11/2015, Revised:23/12/2015, Accepted:31/01/2016
Abstract
Background: Anthrax is a common illness between human and animal which the agent of that is Bacillus anthracis. The modified protective antigen cab be used in treatment and vaccination. The aim of this study is the recombinant expression of modified protective antigen in E. coli.
Material and Methods: Gene fragments were amplified with PCR from pXOI and fusion gene from SOEing PCR was cloned in a cloning vector and finally sub cloned in pET28a(+) vector and transferred to E. coli BL21(DE3) competent cells. Recombinant expression of modified PA was induced by IPTG and after protein purification with affinity chromatography, resulted antigen was injected to mice in 4 repeats. Polyclonal antibodies produced in mice serum was accessed.
Results: The modified protective antigen cloned in expression vector pET28a(+) was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. Recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and western blot. Serum was separated from mice blood and titre of antibody against modified PA was assessed by indirect ELYSA.
Conclusion: resulted protein has high inhibitory property for LF and EF virulence factors. By consideration in PA detection by polyclonal antibody against modified PA from Bacillus anthracis, it can be used in for treatment and prophylaxis against anthrax in individual or combination forms with other PA domains.
Keywords: protective antigen, Bacillus anthracis, recombinant protein
Corresponding author:
Hossein honari,
Imam Hosein University, Tehran
E-mail: honari.hosein@gmail.com
- Ahmadi AH, Honari H, EbrahimMinaei M. Cloning, fusion and expression of domain a-1 protective antigen (PA20) of Bacillus anthracis and N-Terminal ipaD gene of Shigella in E. coli. Qom Univ Med Sci 2015; 9(4): 20-29. (Persian)
- Koehler TM. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol Aspects Med. 2009; 30(6): 386-396.
- Honari H, Mehrazin H, Saadati M, Minaie ME. Production of polycolonal antibody against domain 2-4 of protective antigen of Bacillus anthracis in laboratory animal. J ShahrekordUni Med Sci 2014; 15(6): 35-43. (Persian)
- Bragg TS, Robertson DL. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lef) from Bacillus anthracis. Gene. 1989; 81(1): 45-54.
- Benson E, Huynh P, Finklestein A, Collier R. Identification of residues lining the anthrax protective antigen channel. Biochemistry. 1998; 37(11): 3941-8.
- Turnbull Panthrax vaccines: past, present and future. Vaccine. 1991; 9: 533-539.
- Abboud N, Casadevall A. Immunogenicity of Bacillus anthracis Protective Antigen Domains and Efficacy of Elicited Antibody Responses Depend on Host Genetic Background. Clinical and vaccine immunology, 2008; p: 1115–1123.
- P13423(PAG_BACAN), Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot. [Last modified October 5, 2010; Version 109].
- Honari H, Baranvand M, EbrahimMinaei M. Immunogenicity Investigation of recombinant proteins (StxB) of Shigelladysenteriae type 1 in mice. Quarterly J of SabzevarUni of Med Sci. 2015; 21(6):1111. (Persian)
- Little SF, Webster WM, Norris SLW, Andrews GP. Evaluation of an anti-rPAIgG ELISA for measuring the antibody response in mice. Biologicals. 2004; 32(2): 62-9.
- Friedlander A. M. Tackling anthrax. Nature. 2001; 414:160–161.
- Singh, Y. B. E. Ivins, and S. H. Leppla. Study of immunization against anthrax with the purified recombinant protective antigen of Bacillus anthracis. Infect Immun. 1998; 66:3447–3448.
- Grabenstein J D. Vaccines: countering antrax: vaccines and immunoglobulins. Clin Infect Dis. 2008; 46:129–136.
- Sloat, B. R. and Z. Cui. Nasal immunization with anthrax protective antigen protein adjuvanted with polyriboinosinic-polyribocytidylic acid induced strong mucosal and systemic immunities. Pharm Res. 2006; 23:1217–1226.
- Pezard C, Sirard JC and Mock M. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin mutant strains. AdvExp Med Biol. 1996; 397: 69–72.
- Ivins B,Welkos S.Recent advances in the development of an improved human anthrax vaccine. Eur J Epidemiol. 1988; 4(1): 12-9.
- Mourez, M. M. Yan, D. B. Lacy, L. Dillon, L. Bentsen, A. Marpoe, C. Maurin, E. Hotze, D. Wigelsworth, R. A. Pimental, J. D. Ballard, R. J. Collier, and R. K. Tweten. Mapping dominant-negative mutations of anthrax protective antigen by scanning mutagenesis. ProcNatlAcadSci USA. 2003; 100:13803–13808.
- Yan M, Roehrl M H, Basar E, Wang J Y. Selection and evaluation of the immunogenicity of protective antigen mutants as anthrax vaccine candidates. Vaccine. 2008; 26: 947–955.
- Sun J, E Lang A, Aktories K, Collier R J. Phenylalanine-427 of anthrax protective antigen functions in both pore formation and protein translocation. 2008; 105(11): 4346-4351.
- Cao S, Guo A, Liu Z, Tan Y, Wu G, Zhang Ch, Zhao Y, Chen H. Investigation of New Dominant-Negative Inhibitors of Anthrax Protective Antigen Mutants for Use in Therapy and Vaccination. American Society for Microbiology. 2009; 77(10): 4679–4687.