Authors
Abstract
Background & objective: Due to the side effects of synthetic antioxidants, bioactive agents derived from natural sources are of great importance. The purpose of this study was to identify and characterize an antioxidant peptide derived from enzymatic hydrolysis of β-casein in camel milk, using pepsin and pancreatin.
Materials and Methods: Enzymatic hydrolysis of camel milk had accomplished using pepsin and pancreatin. The hydrolysate was fractioned using RP-HPLC and the peptide of interest was identified with MALD-TOF/TOF technique. Antioxidant activity of isolated peptide was measured by the use of radical scavenging DPPH, ABTS, hydroxyl and superoxide and inhibition of linoleic acid oxidation.
Results: The results of sequencing showed that a purified peptide, called RQ-8, has the sequence of RGLHPVPQ with molecular weight of 903.41 Da. This peptide inhibited oxidation of linoleic acid and also had scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (IC50=0.046 mg/ml), 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazo-line-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) (IC50 = 0.085 mg/ml), superoxide (O2·-) (IC50 = 0.156 mg/ml) and hydroxyl (OH ·-) (IC50 = 0.021 mg/ml) radicals. In addition, cellular activity assays showed that the RQ-8 peptide had no toxicity on A549 lung cancer cell line.
Conclusion: Results indicated that the peptide RQ-8 isolated from camel milk β-casein protein has a strong antioxidant activity.
Keywords
مقاله پژوهشی |
مسعود همایونی تبریزی1، احمد آسوده2، هدا شبستریان3
1استادیار، گروه بیوشیمی بیوفیزیک، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران
2 دانشیار، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
3 دانشجوی کارشناسی ارشد ، گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
نشانی نویسنده مسوول: مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، مسعود همایونی تبریزی
E-mail: mhomayouni6@gmail.com
وصول:22/5/93، اصلاح:1/6/93، پذیرش:11/8/93
چکیده
زمینه و هدف: از آنجاکه آنتیاکسیدانتهای سنتزی، دارای اثرات جانبی است، لذا استخراج آنتیاکسیدانتها از منابع طبیعی فاقد اثرات جانبی مورد نیاز است. هدف از این تحقیق، شناسایی پپتید حاصل از هیدرولیز آنزیمی β-کازئین شیر شتر با پپسین و پانکراتین است.
مواد و روشها: هیدرولیز آنزیمی پروتئین β-کازئین شیر شتر با استفاده از آنزیمهای پپسین و پانکراتین انجامشد. سپس فرکشنها بااستفاده از RP-HPLCجداشدند و توالی پپتید با استفاده از اسپکتروفتومتری MALD-TOFشناساییشد. فعالیت آنتیاکسیدانتی پپتید جداشده با روشهای جذب رادیکالهای DPPH، ABTS، هیدروکسیل و سوپراکسید و مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید سنجششد.
یافتهها: نتایج تعیین توالی نشانداد که پپتید خالصشده با نام RQ-8 دارای توالی RGLHPVPQ و وزن ملکولی41/903 دالتون است. این پپتید اکسیداسیون لینولئیک اسید را، مهار و بهعنوان جذبکنندهی رادیکال 1،1- دیفنیل-2- پیکریل ـ هیدرازیل (DPPH)(IC50 = 0.046 mg/ml) و2،2-آزینو بیس(3-اتیل بنزوتیازولین 6- سلفونیک اسید)(ABTS)(IC50 = 0.085 mg/ ml)، سوپراکسید(O2º−)(IC50= 0.156 mg/ml)، و هیدروکسیل (OHº−) (IC50 = 0.021 mg/ml) عملکرده است. علاوه برآن، سنجشهای فعالیت سلولی نشانداد که این پپتید RQ-8شناساییشده، هیچ سمیّتی بر روی سلولهای سرطانی ریهA549 ندارد.
نتیجهگیری: این نتایج نشانداد که پپتید RQ-8جداشده از پروتئین کازئین شیر شتر، دارای فعالیت آنتیاکسیدانتی است.
واژهایکلیدی: شیر شتر، پپتید، فعالیت آنتی اکسیدانت
مقدمه
استرس اکسیداتیو بهعلت عدم تعادل بین تولید رادیکالهای آزاد و واکنشهای متابولیسمی ایجادمیشود. در سلولها، ترکیبات اکسیدانت یا گونههای واکنشی اکسیژن (ROS) باید بهوسیلهی سازوکارهای حفاظتی حذف شوند. سیستمهای دفاعی آنتیاکسیدانتی، تحت شرایط طبیعی میتوانند گونههای فعال واکنشی را بهواسطهی روش آنزیماتیک (مانند سوپراکسید دیسموتاز سیتوزولی و میتوکندریایی، گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز) و آنتیاکسیدانتهای غیرآنزیمی (مانند ویتامینهای آنتیاکسیدانتی A، C و E- کوآنزیمها و کوفاکتورها) خنثیکنند .بنابراین، سیستم دفاعی آندوژن، بدن را در مقابل رادیکالهای واکنشی حفظ میکند. در شرایط استرس اکسیداتیو تولید ملکولهای واکنشی با قدرت بالایی مانند: ROS (گونههای واکنشی اکسیژن)، رادیکال هیدروکسیل ((OH·، رادیکال پروکسیل OOR·))، آنیون سوپر اکسید(O2-·) و RNS (گونههای واکنشی نیتروژن) مانند پراکسید نیترید (-ONOO) افزایشمییابد (1و2). در انسان استرس اکسیداتیو معمولاً در شروع بیماریهای مزمن نقش بازی میکند و ازاینرو، ضرورتدارد تا آنتیاکسیدانتهای سنتزی و طبیعی تولیدشوند که بتواند از استرس اکسیداتیو و اثرات زیانآور آنها جلوگیریکنند. استفاده از آنتیاکسیدانتهای سنتزی برای جلوگیری از اثرات زیانبار رایکالهای آزاد موثرتر است، اما با بروز اثرات جانبی همراه هستند. رویکرد دیگر استفاده از پپتیدهای آنتیاکسیدانتی با منشاء طبیعی است که اثرات جانبی کمتری ازخود نشانمیدهند(3).
پپتیدهای فعال زیستی، پپتیدهای مشتقشدهی غذایی هستند که فراتر از ارزش غذاییشان اثرات فیزیولوژیک و شبههورمونی در بدن دارند. این گونه پپتیدها در شیر، تخممرغ، گوشت و ماهیها و همچنین در گیاهان یافتهمیشوند(4). پپتیدهای فعال زیستی در توالی پروتئین والد خود غیرفعال هستند (پپتیدهای فعال زیستی قطعههای پروتئینی خاص غیرفعال با توالی پروتئین پیشساز هستند) و میتوانند بهوسیلهی هیدرولیز آنزیمی درطی هضم معدی رودهای یا درطی پردازش غذایی آزادشوند (همانند کاملشدن پنیر و تخمیر شیر). پپتیدهای فعالزیستی معمولا دارای 2 تا 20 اسید آمینه میباشند(5). بهدنبال هضم، پپتیدهای فعالزیستی میتوانند ازطریق روده، وارد گردش خون شوند و اثر سیستماتیک خود را اعمالکنند، یا اثری موضعی در مجرای معدی رودهای ایجادکنند. خصوصیت ساختاری و ترکیب آمینواسید و توالی این پپتیدها، ممکناست نقشهای متنوعی را، شامل: شبه-افیونی، اتصال مواد معدنی، تعدیل ایمنی، ضد میکروبی، آنتیاکسیدانت، ضد انعقادی، کاهشدهندهی کلسترول و کاهشدهندهی فشار خون بازیکنند. بسیاری از پپتیدهای فعالزیستی شناختهشده، چند عملکردی هستند و میتوانند بیش ازیک اثر زیستی داشته و حتی بهعنوان ترکیبات غذاهای فعال یا مواد مغذّی مورداستفاده قرارگیرند. بههرحال، پروتئینهای شیر شتر، میتوانند بهعنوان منبع اصلی برخی از پپتیدهای فعالزیستی عملکنند که تاکنون تحقیقی دراین زمینه انجامنشدهاست. هدف از این تحقیق، شناسایی پپتیدآنتیاکسیدانتی حاصل از هیدرولیز آنزیمی β-کازئین شیر شتر با پپسین و پانکراتین است(9 و 8،7،6).
مواد و روشها
مواد مورد استفاده دراین پژوهش، شامل آنزیم پپسین و پانکراتین، ترکیب (DPPH) 2,2-Dipheny-l-picrylhydrazyl، فنانترولین، گلوتاتیون احیاءشده، محلولABTS2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)، Butylated hydroxyanisole(BHA)، کلریدآهن FeCl2 و نیز تریکلرواستیکاسید، اتانول،EDTA و استونیتریلاز بوده که بهترتیب از شرکتهای سیگما ـ آلدریش آمریکا و مرک آلمان خریداری شدند.
تهیهی هیدرولیزات: برای این منظور، در پروتئین β-کازئین شیر شتر با استفاده از آنزیمهای پپسین و پانکراتین، هضم انجامشد(10). عصارهی پروتئین β-کازئین شیر شتردر بافر سدیم فسفات و در pH بهینهی آنزیم 5 بار رقیقسازیشد. سپس به پروتئین رقیقشده بهنسبت 20/1 (آنزیم به سوبسترا، وزنی/ وزنی) آنزیم پپسین در pH اپتیمم 5/2 اضافهشد. دراین لحظه، هیدرولیز پروتئین توسط پپسین شروعشد و بهمدت 120 دقیقه در انکوباتور در دمایCº 37 درجه سانتیگراد قرارگرفت تا پروتئین به هیدرولیزات خود تبدیلشود. سپس به مخلوط واکنش برای هضم بیشتر آنزیم پانکراتین بهنسبت 20/1( وزنی/ وزنی آنزیم به سوبسترا) اضافهشد ولی قبل از اضافهکردن این آنزیم، pH مخلوط به 5/7 رساندهشد.
پس ازاتمام زمان هیدرولیز، محلول برای 15 دقیقه در آب جوش قرارگرفت تا فعالیت آنزیم متوقفشود. سپس سوسپانسیون حاصل در 8000 دور در دقیقه (rpm)برای 15 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی بهعنوان هیدرولیزات جداسازیشد. سپس با کمک دستگاه اولترافیلتراسیون و با غشائ 3000 دالتون، پپتیدهای کوچکتر از این محدوده تهیهشد. فرایند جداسازی پپتیدها طی چند مرحله صورتگرفت. در هر مرحله، برای انجام فرایند کروماتوگرافی بر روی هیدرولیزات، از ستون C-18 مخصوص جداسازی نیمه کمی استفادهشد. برای این منظور، دو حلال آب و استونیتریل که حاوی1/0% تری فلوئورو استیک اسید در هر حلال بودند، موزد استفاده قرارگرفت. همچنین نمونه هر بار با غلظت 30 میلیگرم بر میلیلیتر در آب، تهیه و به دستگاه تزریق شد. فرایند تفکیک پپتیدها در شیب غلظت متغیری از دو حلال نسبت به زمان صورتگرفت. بهگونهای که درصد ترکیب دو حلال در زمان شروع فرایند تا دقیقهی پنجم، شامل %95 آب و %5 استونیتریل بود. این ترکیب طی مدت 40 دقیقه به %60 آب %40 استونیتریل رسید و سپس طی مدت 15 دقیقه مجدداً به وضعیت اول؛ یعنی %95 آب و %5 استونیتریل بازگشت. طی این مدت سرعت جریان حلال مورد استفاده، برابر با 2 میلی لیتر بر دقیقه بود. فراکشنهای مختلف پس از جمعآوری با فریز درایر خشک شدند.
بررسی قابلیت حذف رادیکال:DPPH این آزمایش با کمی تغییرات در روش وو و همکاران صورتگرفت(11). 5/0 میلی لیتر محلول DPPH 1/0 میلی مولار تهیهشده در اتانول %95 با 100 میکرولیتر محلول پپتید یا استاندارد مخلوطشد. محلول حاصلشده بهمدت 30 دقیقه در تاریکی و دمای 37 درجهی سانتیگراد قرارگرفت. سپس جذب نمونهها درطول موج 517 نانومتر خواندهشد. بهمنظور مقایسهی فعالیت پپتید از ترکیب استاندارد، گلوتاتیون احیاء(GSH) بهعنوان یک آنتیاکسیدان استاندارد استفادهشد. برای تعیین مقدار IC50(IC50 غلظت مورد نیاز برای مهار 50 درصد فعالیت آنتیاکسیدانتی تعریفمیشود). برای پپتید و ترکیب استاندارد، آزمایش در هشت غلظت مختلف از محلول پپتید و استاندارد صورتگرفت. هر آزمایش در سه نوبت، انجام شد و مقادیر میانگین ملاک محاسبات قرارگرفت. درصد فعالیت رادیکال زدایی ازطریق رابطهی ذیل محاسبه شد:
واکنش.جذب-بلانک.جذب |
×100=درصد جذب رادیکال |
بلانک.جذب |
در این رابطه، جذب بلانک، نشاندهندهی جذب محلول شاهد است که محتوای 5/0 میلیلیتر محلول DPPH 1/0 میلی مولار و100 میکرولیتر اتانول %95 بهجای محلول پپتید است و جذب واکنش، نشاندهندهی جذب محلول محتوای نمونهی پپتید است.
بررسی قابلیت حذف رادیکال ABTS: این روش هم برای ترکیبات هیدروفیل و هم برای ترکیبات لیپوفیل قابلاستفاده است. برای انجام این آزمایش، از روش ری و همکاران استفادهشد(12). بهمنظور تهیهی محلول رادیکال ABTS،2میلیلیتر ABTS 7 میلی مولار و 1 میلیلیتر پتاسیم پرسولفات 45/2 میلی مولار با یکدیگر مخلوطگردید و بهمدت 16 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجه سانتیگراد قراردادهشد. محلول حاصل با افزودن آب، تا رسیدن به جذب 756/0 درطول موج 743 نانومتر رقیق شد. غلظت محلول رقیقشده حدود 514/0 میلی مولار بود. سپس1 میلی لیتر از محلول رقیقشدهی رادیکال ABTS با 100 میکرولیتر محلول پپتید مخلوطشد و جذب محلول واکنش تا حدود دقیقهی هفتم؛ یعنی تا زمانی که فعالیت نمونه بهمقدار بیشینهی خود برسد، پیگیریشد. این آزمایش برای بهدستآوردن IC50 در هشت غلظت مختلف از پپتید و ترکیب استاندارد صورتگرفت. ترکیب استفادهشدهی استاندارد در اینجا، ترکیب گلوتاتیون بود. محلول شاهد محتوای 100 میکرولیتر آب مقطر به جای محلول پپتید یا استاندارد بود. این آزمایش در سه نوبت انجامشد و مقادیر میانگین، ملاک محاسبات قرارگرفت. درصد فعالیت حذف رادیکال از رابطهی ذیل بهدستآمد:
واکنش.جذب-بلانک.جذب |
×100=درصد جذب رادیکال |
بلانک.جذب |
در این رابطه بلانک نمایندهی جذب محلول شاهد و جذب واکنش نشاندهندهی جذب محلول نمونه است.
اندازهگیری و محاسبهی اثرگذاری پپتید در حذف رادیکالهای هیدروکسیل OH.: دراین آزمایش، رادیکالهای هیدروکسیل در سیستم فنانترولین/ EDTA/H2O2، تولید و حذف آن توسط پپتید اندازهگیریشد. روش کار بهصورت ذیل انجام شد :
e 2+ + H2O2→ Fe 3+ + OH.+ OH-
فعالیت حذف رادیکالهای هیدروکسیل با استفاده از روش Lijun و همکاران صورتگرفت(11). بهاین ترتیبکه در ابتدا، مخلوطی از 600 میکرولیتر فنانترولین با غلظت 5 میلیمولار، 600 میکرولیتر سولفات آهن با غلظت 5 میلیمولار، 600 میکرولیتر EDTA با غلظت 15 میلیمولار و 400 میکرولیتر بافر سدیم فسفات با غلظت 2/0 مولار و4/7pH= آمادهشد، سپس 600 میکرولیتر از نمونهی پپتیدی با غلظت 1 میلیگرم بر میلیلیتر به محلول و درنهایت 800 میکرولیتر آب اکسیژنه اضافهشد. مخلوط ساختهشده بهمدت 1 ساعت در دمای°C37 ، انکوبه و جذب آن توسط دستگاه طیفسنجی UV درناحیهی 536 نانومتر اندازهگیریشد. نتایج حاصل از فعالیت پپتید، توسط فرمول ذیل محاسبهشد(13):
= (AS – A0) × 100/ (AC –A0)درصد فعالیت حذف رادیکالهای هیدروکسیل
در رابطهی بالا AS جذب نمونه، A0جذب محلول شاهد(محلول حاوی آب بهجای نمونه) و ACجذب محلول کنترل در غیاب H2O2 است.
سنجش فعالیت جذب رادیکال سوپر اکسیدبا استفاده از روش پونال انجامشد(14). 80 میکرولیتر از پپتید یا آسکوربیک اسید به عنوان استاندارد با 80 میکرولیتر بافر تریس50 میلی مولار 3/8 pH=به داخل پلیت 96 چاهک ریختهشد.40 میکرولیتر از محلول پیروگالول در HCl 10 میلی مولار به هر چاهک اضافهگردید. جذب پس از 4 دقیقه درطول موج 420 نانومتر خواندهشد. فعالیت آنتیاکسیدانت در حضور و غیاب پیروگالول و پپتید از رابطهی ذیل محاسبهشد:.
واکنش.جذب-کنترل.جذب |
×100=درصد جذب رادیکال |
کنترل.جذب |
سنجش فعالیت مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید: فعالیت مهار اکسیداسیون اسید چرب لینولئیک اسید پپتیدRQ-8، اندازهگیریشد(15). بهطورخلاصه، پپتید در 5/2 میلیلیتر بافر فسفات50 میلی مولار7pH=حل شد و 5/2 میلیلیتر اتانل5/99 درصدو 5/32 میکرولیتر لینولئیک اسید به آن اضافهشد و حجم نهایی با استفاده از آب مقطر به 25/6 میلیلیتر رسید. محلول در یک لولهی در پیچدار، ریخته و بهمدت 7 روز نگهداری با دمای 60 درجه سانتیگراد در انکوباتور قراردادهشد. سپس در زمانهای مختلف مقدار 50 میکرولیتر از محلول انتخابشد و 35/2 میلیلیتر از اتانول 75%، 50 میکرولیترآمونیوم تیوسیانات 30% و 50 میکرولیتر دی کلرید آهن با غلظت20 میلیمولار حلشده در اسیدکلریک 5/3%، به آن اضافهگردید. پس از 5 دقیقه جذب محلول در طول موج 500 نانومتر ثبتشد. هرچه پپتید فعالیت بهتری داشتهباشد، افزایش جذب کمتر، پیشخواهدآمد. دراین آزمایش، از گلوتاتیون بهجای پپتید، بهعنوان پپتید استاندارد و از بافر سدیم فسفات، بهعنوان استاندارد منفی استفاده شد.
سنجش سمیّت: سنجش سمیّت با استفاده از روش موسمان انجامشد(16).سلولهایA549 مورد استفاده دراین پژوهش از بانک سلولی انسیتو پاستور تهران خریداریشد. این سلولها در محیط کشت RPMI حاوی پنیسیلین و استرپتومایسین و سرم جنین گاوی 10 درصد و در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 و95 درصد رطوبت و دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداریشد. سلولها به میزان 1×105 cells/ml در میکرو پلیت 96 خانه ریختهشد. سپس سلولها با غلظتهای متفاوت پپتید صفر تا یک میلیگرم بر میلیلیتر بهمدت 48،24 و72 ساعت انکوبهشد. محلول بافر فسفات بهعنوان کنترل استفادهگردید. بعد از انکوباسیون محیط کشت دور ریختهشد و مقدار 20 میکرولیتر از محلول3 - ( 4و 5 - دی متیل تیازول 2- ایل) 2و 5- دی فنیل تیازولیوم برمیدMTT به هر چاهک، اضافه و پلیت برای 4 ساعت در انکوباتور قرارداده شد.پس از گذشت این زمان، محیط کشت وMTT از چاهک، خارج و بلورهای فورمازان تشکیلشده در سلولهای زنده در 150 میکرولیتر محلول دی متیل سولفواکساید(DMSO) حلشد و محلول بنفش رنگی با درجات رنگ متفاوت آمادهگردید. شدت رنگ این محلولها که معیاری از تعداد سلولهای زنده در محیط است، در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه ELISA plate reader سنجششد و میزان حیات سلولی با استفاده از معادلهی ذیل محاسبهگردید:
100×جذب.کنترل/(جذب.نمونه-1)=درصد سمیت
جذب.نمونه=جذب نمونه تیمار شده در 570 نانومتر
جذب.کنترل =جذب نمونه سلول بدون تیمار در 570 نانومتر
سنجش فعالیت همولیز: فعالیت همولیز پپتید RQ-8 با استفاده از سلولهای قرمز خونی تازهی فردی از انسان با گروه خونی(O+) مطالعه شد.5میلیلیتر از خون در50 میکرولیتر EDTA در دور rpm 4500 بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی (پلاسما)، دور ریخته و سلولهای قرمز خون با بافر فسفات 3 بار شستهشد و در rpm4500 سانتریفیوژگردید تا اریتروسیتها بهطور کامل از پلاسما جدا شود. سپس فعالیت همولتیک با روش اسپکتروفتومتری انجامشد. سرانجام 20 میلیلیتر بافر فسفات به سلولهای قرمز خون اضافهشد. درانتها، 10 میکرولیتر از پپتید RQ-8 در غلظتهای12.5، 50،25، 100و 200 میکروگرم بر میلیلیتر به 190 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی اضافهشد. مخلوط برای 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد نگهداریشد. سپس نمونهها در دور rpm 4000 برای 5 دقیقه سانتریفیوژشد. 100 میکرو لیتر از محلول رویی با یک میلیلیتر از بافر فسفات رقیقگردید و هموگلوبین در محلول رویی در 560 نانومتر با اسپکتروفتومتری اندازهگیریشد. بافر فسفات بهعنوان کنترل منفی استفادهشد(17).
روش تجزیه و تحلیل آماری دادهها: درصد زندهماندن سلولها، با استفاده از نرمافزار اکسل محاسبهگردید. همچنین انحراف معیار و انحراف از میانگین دادهها و روش تجزیه و تحلیل آماری دادهها بهوسیلهی نرمافزارSPSS محاسبهشد. بهمنظور مقایسهی بقاع سلولهای تیمار شده با پپتید و بررسی وجود اختلاف معنادار در نتایج حاصل شده، از نرمافزار SPSSو آزمون آنالیز واریانس یکطرفه(one-way ANOVA) و تست Tukey استفاده شد.
یافتهها
در این پژوهش، پروتئینهای شیر شتر با استفاده از دو آنزیم پپسینو پانکراتین هیدرولیز شد. هیدرولیزاتها با استفاده از روشهای اولترافیلتراسیونو RP-HPLC جداسازی شدند. یک فراکشن با بیشترین مقدار سطح پیک در کروماتوگرام RP-HPLC دیده شد (شکل.1). بهمنظور دستیابی به خلوص بیشتر، نمونهی جمعشده از پیک اصلی، مجدداً با روش RP-HPLC با همان شرایط خالص سازی شدند. پپتید خالص با دستگاه اسپکتروفتومتری MALDI-TOF/TOF تعیین توالی شد. آنالیز نتایج طیفسنجی جرمی توالی، پپتید RGLHPVPQ (که وزن ملکولی آن41/903 دالتون میباشد) را برای پپتید جداشده نشانداد. این پپتید بهاختصار RQ-8 نامگذاریشد (شکل.2).
شکل1: کروماتوگرام های RP-HPLC هیدرولیزات پروتئین کازوئین شیر شتر با آنزیم های پپسین و پانکراتین. پیک اصلی خارج شده در دقیقه27 (مشخص شده با ستاره) جمع آوری و پس از خالص سازی مجدد، توالی پپتید آن با کمک طیف سنجی جرمی تعیین شد.
شکل 2: طیف اسپکتروفتومتری جرمی پپتید خالص شده. ( a) جرم قطعاتایجاد شده از پپتید اولیهRQ-8 ، (b) تفسیر نتایج جرمی و تعیین توالی پپتید ِRQ-8..
|
(شکل 4) مهار اکسیداسیون اسید لینولئیک را نشانمیدهد. پپتید RQ-8 ازتشکیل محصول اکسیداسیون لیپیدی جلوگیریکرده است. دورهی مهار اکسیداسیون لیپید با آنتیاکسیدانتBHA مقایسهشد. میزان فعالیت مهاریBHA بیشتر از پپتید مشاهدهشد.
شکل3: فعالیت جذب رادیکالهای (الف) DPPH، (ب) هیدروکسیل، (پ) سوپراکسید، (ت) ABTS.گلوتاتیون (GSH) و اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند.
|
بحث
بهطورکل، پپتیدهای آنتیاکسیدانت قادر به عمل بهعنوان جاذب رادیکالی، دهندهی پروتون و شلاتهکنندهی یون هستند. توالی پپتیدهای زیستی، فاکتور تعیینکننده در فعالیت آنتیاکسیدانتهاست. حضور ریشههای اسید آمینهای مشخص، بهمخصوص هیستیدین، تیروزین، تریپتوفان، میتونین، سیستئین و پرولین، بهطور معناداری با فعالیت خاموشکنندگی پپتیدها همبستگی دارند(18و19).
شکل4: سنجش مهار اکسیداسیون اسید لینولئیک پپتید RQ-8، BHA به عنوان کنترل مثبت و بافر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
شکل5:(الف) تاثیر پپتید RQ-8 بر قابلیت زیستی سلولهای A549..(ب) فعالیت همولیز پپتید RQ-8 در مقابل اریتروسیت- های انسانی سنجش شد. سنجش برای همه آزمایشات بصورت 3 بار تکرار انجام شد.
|
در مطالعهی دیگری، بررسی خصوصیات آنتیاکسیدانتی و ضدالتهابی پپتید lunasin برای جلوگیری سلولهای سرطانی ماکروفاژهای RAW 264.7 صورتگرفت. استرس اکسیداتیو و التهاب دو فاکتور حیاتی نشاندادهشده در سرطان و بیماریهای نابودکننده است. دراین مطالعه، نشان داده شده که این پپتید چطور اثر ضد سرطان دارد. پپتید lunasin شامل 43 اسید آمینهی دانهای سویای جدا شدهاست. این پپتید اکسیداسیون لینولئیک را، مهار و بهعنوان جذب رادیکال ABTS عملکرد. این پپتید همچنین آزادکردن سیتوکینهای پیشبرندهی التهاب TNF-α و IL-6 را مهارمیکند. درنتیجه، پپتیدهای دارای فعالیت بالای آنتی اکسیدانتی و ضد اتهاب میتوانند از سرطان جلوگیریکنند (23).
مطالعهی جداسازی و شناسایی پپتیدهای آنتیاکسیدانتی حاصل از هیدرولیز پروتئین کلاژن خوک توسط لی و همکاران صورت گرفت. در این مطالعه، کلاژن پوست خوک بهوسیلهی پروتئازهای متفاوت هیدرولیز شد و پپتید های آنتیاکسیدانتی بهدستآمد. چهار پپتید دارای فعالیت بالای آنتیاکسیدانتی که رادیکال DPPH را، جذب و بهعنوان شلاتهکنندهی فلزات، عمل و پراکسیداسیون لینولئیک اسید را مهارمیکند، وجوددارد. این چهار پپتید توسط سیستم کروماتوگرافی متوالی ابتدا ژل فیلتراسیون، تعویض یونی و HPLC جداشدند. وزن ملکولی و توالی پپتیدهای جداشده توسط دستگاه اسپکترومتری جرمی محاسبه شد. یک پپتیدی دارای فعالیت بالای آنتیاکسیدانتی با توالی RQGA سنتز شد (24).
مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی vitroinو vivoin پپتیدهای جداشده از هیدرولیزات پروتئینهای عضلهی وزغ، نشانداد که پپتید خالصشده دارای توالیCGRHKTF و وزن ملکولی 6/861 دالتون است. این پپتید بهعنوان جذبکنندهی رادیکال DPPH، هیدروکسیل و پراکسیداسیون لیپید و آسیب به DNA را مهارمیکند. این پپتید فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی شامل کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز در رَت را افزایش داد(25).
پروتئینهای جداشدهی آب پنیر توسط آلکالاز برای زمانهای 5/0، تا 8 ساعت هیدرولیزشد و مشخصگردید که نمونهی هیدرولیزاتِ ساعت پنجم، فعالیت قویتری دارد. نمونهی هیدرولیزات ساعت پنجم، توسط ستون سفادکس جی-10 ژل کروماتوگرافی جداسازیشد و چهار فرکشن بهدستآمد که متشکل از پپتیدهایی با وزن مولکولی بزرگتر از 40 کیلودالتون، 8/2 تا 40 کیلودالتون، 1/0 تا 8/2 کیلودالتون و کوچکتر از 1/0 کیلودالتون بود که فرکشن سوم فعالیت آنتیاکسیدانی قویتری را نشان داد. درصد فعالیت حذف رادیکال DPPH برای نمونههای ساعت پنجم هیدرولیز و فرکشن های یک تا چهار و همچنین آنتی اکسیدان استاندارد آسکوربات بهترتیب برابر با %33/21، %33/25، %13/47 و %67/58، %73/14 و %33/96 بود. همچنین مقادیر فعالیت حذف رادیکال هیدروکسیل برای نمونههای مذکور، بهترتیب برابر با %33/23، %00/35، %33/47 و %67/65، %33/23 و %33/75 بود(26). در تحقیق، پپتید RQ-8 جداشده از کازئین شیر شتر نشان داد که دارای فعایت آنتیاکسیدانتی مشابه با پپتیدهای جداشده از منابع مختلف است.
توسعهی ترکیبات آنتیاکسیدانتی از منابع طبیعی در علوم زیستی و غذایی مهم است. دراین تحقیق، یک پپتید آنتیاکسیدانتی از پروتئینβ-کازوئین شیر شتر با هضم آنزیمهای پپسین و پانکراتین شناساییکردیم. پپتید آنتیاکسیدانتی RQ-8 با قدرت بالای جذب رادیکالهای آزاد، توانست اکسیداسیون لیپیدها را نیز مهارکند. با این نتایج، پیشنهادمیشود که این پپتید ممکن است نویددهندهی آنتیاکسیدانت برای مکملهای غذایی باشد. هرچند مطالعات بیشتر در سیستم invivo ضروری است.
تشکر و قدر دانی
این مقاله، حاصل طرح تحت عنوان " استخراج و خالصسازی پپتیدهای فعال زیستی از شیرشتر با استفاده از آنزیمهای پروتئاز و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنها" ست که درسال 1392به تصویبرسیده و با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد اجراشدهاست. بدینوسیله نویسندگان مقاله از معاون محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد که در جهت فراهمآوردن امکانات این مطالعه همکاری لازم را مبذول داشتند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.
References
- Zhong S, Ma C, Lin YC, Luo Y. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry. Food Chem. 2011;126(4):1636-42.
- Stadtman ER. Protein oxidation and aging. Free Radic Res. 2006;40(12):1250-8.
- Li Y-W, Li B. Characterization of structure–antioxidant activity relationship of peptides in free radical systems using QSAR models: Key sequence positions and their amino acid properties. J Theor Biol. 2013;318:29-43.
- Taheri A, Sabeena Farvin KH, Jacobsen C, Baron CP. Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fractions isolated from salted herring brine. Food Chem. 2014;142:318-26.
- De Gobba C, Espejo-Carpio FJ, Skibsted LH, Otte J. Antioxidant peptides from goat milk protein fractions hydrolysed by two commercial proteases.Int Dairy J.2013l; 96(7):4242-51.
- Li Z, Jiang A, Yue T, Wang J, Wang Y, Su J. Purification and identification of five novel antioxidant peptides from goat milk casein hydrolysates. J dairy Sci. 2013;96(7):4242-51.
- Hernández-Ledesma B, Quirós A, Amigo L, Recio I. Identification of bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin. Int Dairy J. 2007;17(1):42-9.
- Puchalska P, Marina ML, Garcia MC. Isolation and identification of antioxidant peptides from commercial soybean-based infant formulas. Food Chem. 2014;148:147-54.
- Peng X, Xiong YL, Kong B. Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance. Food Chem. 2009;113(1):196-201.
- Hernandez-Ledesma B, Amigo L, Recio I, Bartolome B. ACE-inhibitory and radical-scavenging activity of peptides derived from beta-lactoglobulin f(19-25). Interactions with ascorbic acid. J Agric Food Chem. 2007;55(9):3392-7.
- Hernandez-Ledesma B, Davalos A, Bartolome B, Amigo L. Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates from alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS. J Agric Food Chem. 2005;53(3):588-93.
- Castro MM, Fandiño RLA, Sanchez MIR, Gonzalez MMR, De Artiñano AA. Bioactive peptides derived from the proteins of egg white by means of enzymatic hydrolysis. 2012;Patent US8227207 B2.
- Saiga A, Tanabe S, Nishimura T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment. J Agric Food Chem. 2003;51(12):3661-7.
- Liu Q, Kong B, Xiong YL, Xia X. Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis. Food Chem. 2010;118(2):403-10.
- Sila A, Sayari N, Balti R, Martinez-Alvarez O, Nedjar-Arroume N, Moncef N, et al. Biochemical and antioxidant properties of peptidic fraction of carotenoproteins generated from shrimp by-products by enzymatic hydrolysis. Food Chem. 2014;148:445-52.
- Byun H-G, Lee JK, Park HG, Jeon J-K, Kim S-K. Antioxidant peptides isolated from the marine rotifer, Brachionus rotundiformis. Process Biochem. 2009;44(8):842-6.
- Rival SG, Boeriu CG, Wichers HJ. Caseins and casein hydrolysates. 2. Antioxidative properties and relevance to lipoxygenase inhibition. J Agric Food Chem. 2001;49(1):295-302.
- Yousef MI. Aluminium-induced changes in hemato-biochemical parameters, lipid peroxidation and enzyme activities of male rabbits: protective role of ascorbic acid. Toxicology. 2004;199(1):47-57.
- Salami M, Yousefi R, Ehsani MR, Razavi SH, Chobert J-M, Haertlé T, et al. Enzymatic digestion and antioxidant activity of the native and molten globule states of camel α-lactalbumin: Possible significance for use in infant formula. Int Dairy J. 2009;19(9):518-23.
- Quiros A, del Mar Contreras M, Ramos M, Amigo L, Recio I. Stability to gastrointestinal enzymes and structure-activity relationship of beta-casein-peptides with antihypertensive properties. Peptides. 2009;30(10):1848-53.
- Haenen HEMG, Bleijlevens E, Elzerman H, Temmink JHM, Koeman JH, Van Bladeren PJ. Cytotoxicity of 2-tert-butyl hydroquinone glutathione conjugates after apical and basolateral exposure of rat renal proximal tubular cell monolayers. Toxicol in Vitro. 1996;10(2):141-8.
- Bougatef A, Nedjar-Arroume N, Manni L, Ravallec R, Barkia A, Guillochon D, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinella aurita) by-products proteins. Food Chem.2010; 118(3): 559-65.
- Sun J, Yu J, Zhang P-C, Tang F, Yue Y-D, Yang Y-N, et al. Isolation and Identification of Lignans from Caulis Bambusae in Taenia with Antioxidant Properties. J Agric Food Chem. 2013;61(19):4556-62.
- Li B, Chen F, Wang X, Ji B, Wu Y. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization–mass spectrometry.Food Chem. 2007;102(4):1135-43.
- Mendis E, Rajapakse N, Byun HG, Kim SK. Investigation of jumbo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects. Life Sci. 2005;77(17):2166-78.
Isolation and identification of a new antioxidant peptide from casein camelmilk using pepsin and pancreatin
Masoud Homayouni-Tabrizi.,
Department of Biochemistry and Biophysics, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran
Ahmad Asoodeh.,
Department of Chemistry, Faculty of Sciences, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.
Hoda Shabestarian.,
Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
Received:13/08/2014, Revised:23/08/2014, Accepted:02/11/2014
Abstract
Background & objective: Due to the side effects of synthetic antioxidants, bioactive agents derived from natural sources are of great importance. The purpose of this study was to identify and characterize an antioxidant peptide derived from enzymatic hydrolysis of β-casein in camel milk, using pepsin and pancreatin.
Materials and Methods: Enzymatic hydrolysis of camel milk had accomplished using pepsin and pancreatin. The hydrolysate was fractioned using RP-HPLC and the peptide of interest was identified with MALD-TOF/TOF technique. Antioxidant activity of isolated peptide was measured by the use of radical scavenging DPPH, ABTS, hydroxyl and superoxide and inhibition of linoleic acid oxidation.
Results: The results of sequencing showed that a purified peptide, called RQ-8, has the sequence of RGLHPVPQ with molecular weight of 903.41 Da. This peptide inhibited oxidation of linoleic acid and also had scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (IC50=0.046 mg/ml), 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazo-line-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) (IC50 = 0.085 mg/ml), superoxide (O2·-) (IC50 = 0.156 mg/ml) and hydroxyl (OH ·-) (IC50 = 0.021 mg/ml) radicals. In addition, cellular activity assays showed that the RQ-8 peptide had no toxicity on A549 lung cancer cell line.
Conclusion: Results indicated that the peptide RQ-8 isolated from camel milk β-casein protein has a strong antioxidant activity.
Keywords: Camel milk, Peptide, Antioxidant activity
Corresponding author:
Masoud Homayouni-Tabrizi,
Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran
E-mail: mhomayouni6@gmail.com