نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد باکتری شناسی، گروه میکروبشناسی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، ایران
2 دانشیار، متخصص باکتری شناسی پزشکی، گروه میکروب شناسی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، عضو مرکز بیماری های عفونی-گرمسیری زاهدان، زاهدان، ایران
چکیده
اهدافمواد ضدعفونی‌کننده و آنتی‌سپتیک‌ها از گذشته برای ضدعفونی‌کردن وسایل و سطوح استفاده می‌شده است. در برخی موارد این مواد به‌واسطة یک سری پروتئین‌های خاصی بی‌اثر می‌شوند که در باکتری ها حضور دارند. از مهم‌ترین ژن‌های به‌وجودآورندة این امر می‌توان بهqacA/Bو smr اشاره کرد که در برخی موارد در سویه‌های استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین (MRSA) دیده می‌شود. هدف از این مطالعه، بررسی ژن‌های qacA/Bو smr در سویه‌های MRSA است.
مواد و روش‌هاهشتادونه ایزوله از نمونه‌های بالینی مختلف (خون، ادرار، کاتاتر، زخم، ترشحات و سایر) به‌واسطة تست بیوشیمیایی اولیه جداسازی شد. غربالگری اولیه برای مقاومت به متیسیلین به‌روش دیسک دیفیوژن سفوکسیتین (30 میکروگرم) انجام شد. بعد از آن با واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) ردیابی ژن‌های 16sRNA، smr و qacA/B انجام‌گرفت. در نهایت، با استفاده از آزمون آماری کای دو نتایج به‌دست‌آمده بررسی شد.
یافته‌هااز مجموع 89 ایزولة جداسازی‌شده، 59 ایزوله با آزمون‌های اولیة فنوتیپی مقاوم به متیسیلین شناخته شد. از این میان 50 ایزوله (74/84 درصد) دارای ژن mecA، 14 ایزوله (73/23 درصد) دارای ژن smr و 29 ایزوله (15/49 درصد) دارای ژن qacA/B بود. با استفاده از آزمون‌های آماری و با توجه به p value به‌دست‌آمده، ارتباط معناداری بین ژن‌های qacA/B و mecA به‌دست آمد.
نتیجه‌گیریبا توجه به نتایج به‌دست‌آمده از شیوع ژن‌های مورد مطالعه در شهر زاهدان و بالابودن فراوانی سویه‌های MRSA، باید با دقت بیشتری به استفاده از مواد ضدعفونی‌کننده پرداخت. به‌دلیل حضور نمونه‌های مقاوم به آنتی‌سپتیک‌ها در ایزوله‌های بالینی جداشده، باید از غلظت مؤثر برای ضدعفونی سطوح و وسایل پزشکی استفاده کرد.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Molecular detection of 16s rRNA, qacA / B, smr in Clinical Isolates of staphylococcus aureus methicillin resistance
نویسندگان [English]
- Hamed Tahmasebi 1
- Mohammad Bokaeian 2
چکیده [English]
Objectives: Disinfectants and antiseptics agents of the past were used for disinfect equipment and surfaces. In some cases, these substances ineffective by a series of specific efflux proteins that are present in bacteria. QqcA / B and smr such as most important genes those can be expression more efflux protein in strain of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA). The aim of this study was to investigate the genes qacA / B and smr is MRSA strains.
Methods: 89 isolates from various clinical samples were early identified by biochemical test. Initial screening was performed by Cefoxitin disk diffusion (30 µg) and then detection of mecA, smr and qacA/B gens was done by polymerase chain reaction (PCR). Finally, were analyzed results by using chi-square tests and t-test.
Results: Out of 89 staphylococcus aureus isolates, 59 isolates were identified methicillin-resistant by initial phenotype test. Among those, 50 isolates (17/56%) have respectively mecA gene, 14 isolates (73/15%) smr gene and 29 isolates (58/32%) qacA / B gene. Using by statistical tests and p.value test, was obtained the relationship between qacA / B and mecA genes.
Conclusions: According to the results of the studie of prevalence of genes in Zahedan and high frequency of MRSA strains, should pay more attention to the use of disinfectants agents.
کلیدواژه‌ها [English]
- qacA/B
- smr
- mecA
- Staphylococcus aureus
مقدمه
پمپ‌های ترشحی چند دارویی پروتئین‌هایی در سطح غشای باکتری‌ها و معمولاً دارای چند کانال انتقالی برای جابه‌جاکردن مواد سمی به خارج از سلول است [1]. بسترهای آن ممکن است بر اساس کاتیون‌ها، ترکیبات چهار ظرفیتی آمونیم (qac) و مشتقات فسفونیم شکل بگیرد [2]. این افلاکس پمپ‌ها ویژگی‌ای محافظتی برای باکتری به‌وجود می‌آورد که سبب خروج مواد سمی راه‌یافته به باکتری‌ها مانند آفت‌کش‌ها، مواد شیمیایی و ضدعفونی‌کننده‌ها می‌شود [3]. حضور مستمر در برابر مواد سمی ژن‌های کدکنندة این کانال‌ها را فعال و در نهایت باکتری را در مقابل آن‌ها مقاوم می‌کند [4]. تعدادی از این ژن‌های مولد افلاکس پمپ‌ها در استافیلوکوکوس‌ها از جمله استافیلوکوک اورئوس شناسایی شده است.
aqcها از جمله پروتئین‌های ترشحی استافیلوکوک اورئوس است که به دو خانوادة پروتئینی Major Facilitator Superfamily (MFS) و Small Multidrug Resistance (SMR) تقسیم می‌شود [5]. ژن‌های qacA/B و smr از جمله ژن‌هایی است که مقاومت به کلرهگزیدین و آنتیموآن‌های چند ظرفیتی را سبب می‌شود. ژن‌های دیگری از جمله qac J و qac H و qac G هم در گروه qac در استافیلوکوک‌ها مطالعه شده است که از نمونه‌های دامی و مواد غذایی- لبنی جداسازی شده است [5]. کلرهگزیدین از جمله ضدعفونی‌کننده‌هایی است که از سال 1945 برای ضدعفونی کاتاترها و ضدعفونی سطوح استفاده می‌شود [2].
در برخی مطالعات، ظهور ژن‌های عامل مقاومـت qac همراه بـا ژن‌هـای کدکننـدة مقاومـت بـه آنتـی بیوتیـک‌هـای جنتامیــسین، تــری‌متــوپریم، پنــی‌سیلین،کانامایــسین و توبرامایسین روی عناصر ژنتیکی متحرک یافت شده است [6، 7]. در امر ضدعفونی سطوح و وسایل پزشکی و جلوگیری از انتشار آلودگی‌های باکتریایی، از ضـدعفونی‌های چهار ظرفیتی آمونیم (qacs) مانند سـتیل پریـدینیوم کلرایـد، بنزالکونیـوم کلرایـد، سـتریماید، پروسـئین و دتیـزور در بیمارستان‌ها استفاده مـی‌شـود [8]. بالابودن فراوانی باکتری استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین (MRSAs) در محیط‌های بیمارستانی و استفادة گسترده از شوینده‌های مختلف در ضدعفونی سطوح و ابزارهای پزشکی، سبب پیداشدن سویه‌های جدیدی شد که حامل ژن‌های مقاومت به موادضدعفونی کننده است [9]. سویه‌های MRSA را نخستین‌بار در سال 1950 در کشور آمریکا شناسایی و گزارش کردند. از سال 1980 در بیشتر بیمارستان‌های دنیا به‌صورت اندمیک درآمد [10 و 11].
سازوکار اصلی مقاومت به متیسیلین در استافیلوکوک اورئوس مربوط به تولید پروتئینی به نام PBP2 است که میل ترکیبی کمی با بتا لاکتام‌ها دارد و سبب مقاومت به بتا لاکتام‌ها می‌شود [12]. PBP4 و PBP2A انواع دیگری از PBP است. به‌دلیل اهمیت PBP2 در ایجاد مقاومت به متیسیلین، به این پروتئین بیشتر پرداخته می‌شود. تولید این پروتئین با ژن‌های mec موجود روی کروموزوم باکتری مرتبط است [13].
در ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس می‌توان برای تأیید مولکولی از ژن 16SrRNA استفاده کرد. علاوه‌بر این، حضور ژن mecA به بروز استافیلوکوک اورئوس‌های مقاوم به متیسیلین کمک می‌کند [14]. تـصور بـر آن اسـت کـه گسترش وسیع در مصرف QACs ممکن اسـت موجـب فـشار انتخابی شود و در پیدایش میکروارگانیزم‌هـای مقـاوم بـه ایـن مواد در محیط‌های کلینیکی دخیل باشـد [15]. در برخی مطالعات، افزایش ایجاد مقاومت در سویه‌های MRSA به عوامل ضدعفونی‌کننده گزارش شده است و در سال 1990 اولین مورد از این سویه گزارش شد که مقاومت به ضدعفونی‌کننده‌ها را پیدا کرده بود [18-16]. ژن‌هـای smr،qac B و qac A که غالباً روی پلاسمید حمل می‌شود، معمولاً به‌دلیل این ویژگی خود، قدرت انتقال بالایی پیدا کرده است. این مطالعه با هدف ردیابی ژن‌های qacA، qacB و smr و مشخص‌کردن شیوع باکتری‌های مقاوم به ضدعفونی‌کننده‌ها، در ایزوله‌های بالینی استافیلوکوک اورئوس جداشده از بیمارستان‌های آموزشی شهر زاهدان در سال 1394 انجام پذیرفت.
مواد و روش‌ها
جمع آوری و شناسایی ایزوله‌های باکتریایی
در این مطالعة توصیفی- مقطعی، طی دوره‌ای شش ماهه، 349 نمونة باکتریایی از بیماران بستری در بخش‌های مختلف مراکز درمانی دانشگاه علوم پزشکی شهر زاهدان در سال 1394 جمع‌آوری شد، شامل نمونه‌های خون، ادرار، زخم، ترشحات، آبسه، سواپ و، کاتاتر و سایر. بعد از کشت اولیه، نمونه‌های جمع‌آوری‌شده داخل میکروتیوب‌های پلاستیکی دردار و حاوی محیط ترانسپورت BHI (Merck آلمان) با 10 درصد گلیسرول تلقیح و برای انجام آزمایش‌های تکمیلی و تشخیصی دقیق‌تر به آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکدة پزشکی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان منتقل شد. تا زمان انجام آزمایش‌ها، نمونه‌ها در دمای 20- درجة سانتی‌گراد نگهداری شد. نمونه‌های به‌دست‌آمده روی محیط Blood Agar (Merck آلمان)پایه که به 5 درصد خون تازة گوسفندی غنی شده بود، به‌صورت خطی کشت داده شد و به‌مدت 24ساعت در دمای 37 درجة انکوبه شد. پس از مشاهدة کلنی‌ها، رنگ‌آمیزی گرم انجام و کوکسی‌های گرم مثبت جداسازی شد.
برای اینکه بتوان استافیلوکوک‌ها را از استرپتوکوک‌ها تفریق داد، از تست کاتالاز با استفاده از کیت ZB-CAT (ZellBio آلمان) استفاده شد. برای تشخیص استافیلوکوک‌ها از میکروکوک‌ها هم از آزمایش اکیسایش و احیا (OF) Oxidation and fermentation test استفاده شد. برای تفکیک استافیلوکوک‌های کوگولاز مثبت از استافیلوکوک‌های کوگولاز منفی از تست کوگولاز لوله‌ایی (با استفاده از کیت Tadbirkit ایران) استفاده شد. در نهایت، 89 ایزوله استافیلوکوک اورئوس بعد از انجام آزمایش‌های افتراقی از مجموع 349 نمونة جمع‌آوری‌شده به‌دست آمد. برای تأیید ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس به‌دست‌آمده از ژن 16SrRNA استفاده شد.
تعیین فنوتیپی سویه‌های مقاوم به متیسیلین به روش دیسک دیفیوژن
برای تعیین سویه‌های مقاوم به متیسیلین از روش دیسک دیفیوژن استفاده شد، به‌طوری که نخست محلول نیم مک‌فارلند از کلنی‌های تعیین هویت‌شده تهیه شد. بعد از کشت در محیط Mueller Hinton agar (Merck آلمان) با ضخامت5 میلی‌متر، دیسک سفوکسیتین 30 میکروگرم و اوگزاسیلین 1 میکروگرم (هر دو mast انگلستان) با پنس استریل روی محیط قرارگرفت و به‌مدت 24ساعت انکوبه شد. بر اساس جدیدترین معیار CLSI 2015، در صورتی که قطر هالة ایجادشده نسبت به دیسک سفوکسیتین بیش از 21 میلی‌متر باشد، استافیلوکوک اورئوس حساس به سفوکسیتین در نظر گرفته می‌شود. در صورتی که قطر هاله نسبت به دیسک سفوکسیتین کمتر از 21 میلی‌متر باشد، ایزولة استافیلوکوک اورئوس مقاوم به سفوکسیتین و در صورتی که قطر هالة ایجادشده نسبت به دیسک اوگزاسیلین بیش از 21 میلی‌متر باشد، استافیلوکوک اورئوس حساس به اوگزاسیلین در نظر گرفته می‌شود [27]. در این مطالعه از سویة استافیلوکوک اورئوس ATCC33591 برای سویة استاندارد کنترل مثبت و از سویة استاندارد استافیلوکوک اورئوس ATCC25923 برای کنترل منفی استفاده شد [28]. این سویه‌های استاندارد از مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های صنعتی ایران و ایزوله‌های استاندارد ذخیره‌شده در بانک باکتریایی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان تهیه شد.
آزمایش‌های مولکولی در تعیین ژن‌های qacA/B،smrوmecAدر ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس
الف) استخراج DNA ژنومی
برای استخراج DNA ژنومی، مراحل اولیه به‌صورت زیر انجام شد. نخست، ایزوله‌های بالینی تأییدشده با آزمایش‌های بیوشیمیایی ذخیره‌شده در 20- درجة سانتی‌گراد روی محیط Blood agar (Merck آلمان) با 5 درصد خون گوسفند، ساب کالچر داده شد و در دمای 37 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 24 ساعت انکوبه شد. سپس، یک کلنی از هر ایزولة کشت‌داده‌شده به 5 میلی‌لیتر محیط کشت LB Btoth (Merck آلمان) تلقیح شد که قبلاً درون لوله‌های دردار شیشه‌ایی به تعداد ایزوله‌ها تقسیم و شماری‌گذاری شده بود و در دمای 37 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 20 ساعت انکوبه شد. 5/1 سی‌سی از محیط کشت حاصل، درون میکروتیوب‌های دردار 5/1 پلاستیکی ریخته و مراحل استخراج DNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج سینا ژن ایران (Cat. No.PR881614) بر اساس پرتکل شرکت سازنده انجام شد. DNA به‌دست‌آمده در دمای 20- درجة سانتی‌گراد برای انجام آزمون‌های مولکولی ذخیره شد.
ب) آماده‌سازی پرایمرها
پرایمرهای تهیه‌شده از شرکت ماکروژن به سفارش شرکت پیشگام ایران، بعد اضافه‌کردن حجم مورد نظر آب مقطر به رقت اولیة 100 پیکومولار رسانده شد. از پرایمرهای forwardو reverse رقت 20 پیکومولار تهیه شد. بعد از قراردادن پرایمرها در دمای 4+ درجة سانتی‌گراد به‌مدت 4 ساعت، رقت‌های استوک برای انجام آزمایش‌های بعدی تهیه و در دمای 20- نگهداری شد. در این روند، از پرایمرهای جدول 1 برای تکثیر ژن‌های qacA/B، mecA و smr در نمونه‌های مورد نظر استفاده شد.
ج) واکنش PCR
برای انجام واکنش PCR، 25 میکرولیتر از محلول نهایی شامل 1 میکرولیتر از DNA الگو، 1 میکرولیتر از هر پرایمر با غلظت 25 پیکومولار و 5/12 میکرولیتر از مستر میکس 2x and 1.5 mM MgCl2 (شرکت Ampliqon آلمان) شامل Tris-Hcl pH 8.5، (NH4) SO4، 3 mM Mgcl2، 0.2% Tween 20، 4/MmdNTP 4، 2/0 unit Ampliqon polymeras، Insert red dye and stabilizer استفاده شد. برای رساندن به حجم نهایی آب مقطر دیونیزه به‌کار رفت. از مخلوط PCR فاقد DNA الگو برای کنترل منفی استفاده شد [14]. آزمون PCR برای ژن‌ها با استفاده از دستگاه ترموسایکلر Corbett CGI-96 (ساخت کشور آمریکا) طبق الگوی جدول 2 تنظیم شد [14].
جدول 1. فهرست پرایمرهای اختصاصی استفاده‌شده برای شناسایی تکثیر ژن‌هایqacA/B، mecA و smr
|
منبع |
اندازه (bp) |
طول توالی |
پرایمر |
ژن‌های مورد نظر |
|
راگی و همکاران [19] |
157 |
CCACTACAGATTCTTCAGCTACATG CTATGGCAATAGGAGATATGGTGT |
qacA/B F qacA/B R |
qacA/B |
|
نهایی و همکاران [20] |
533 |
AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC |
mecA-F mecA-R |
mecA |
|
نوقاچی و همکاران [21] |
195 |
GCCATAAGTACTGAAGTTATTGGA GACTACGGTTGTTAAGACTAAACCT |
smr F smr R |
smr |
|
مک‌کلور و همکاران [29] |
750 |
AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC |
Staph756F Staph750R |
16sRNA |
جدول 2. تنظیمات ترموسایکلر در تکثیر ژن‌هـای smr، qacA/B، mecA و 16SrRNA در ایزوله‌های بالینی استافیلوکوک اورئوس
|
ژن |
مراحل |
دما (سانتی‌گراد) |
زمان (ثانیه) |
تعداد سیکل |
|
qacA/B |
شوک حرارتی اولیه |
94 |
180 |
1 |
|
جداشدن قطعات DNA جفت‌شدن پرایمرها طویل‌شدن پرایمرها |
94 54 72 |
40 40 40 |
25 |
|
|
طویل‌شدن نهایی |
72 |
150 |
1 |
|
|
mecA |
شوک حرارتی اولیه |
94 |
180 |
1 |
|
جداشدن قطعات DNA جفت‌شدن پرایمرها طویل‌شدن پرایمرها |
94 55 72 |
30 30 30 |
30 |
|
|
طویل‌شدن نهایی |
72 |
180 |
1 |
|
|
smr |
شوک حرارتی اولیه |
94 |
180 |
1 |
|
جداشدن قطعات DNA جفت‌شدن پرایمرها طویل‌شدن پرایمرها |
94 54 72 |
40 40 40 |
25 |
|
|
طویل‌شدن نهایی |
72 |
150 |
1 |
الکتروفورز روی ژل اگارز 1 درصد
پنج میکرولیتر از محصول نهایی PCR در ژل اگارز 1 درصد در بافر X5/0 الکتروفورز و برای مشاهدة باندها استفاده شد. هنگام تهیة ژل به آن 5 میکرولیتر محلول Gel Red (Biotium آمریکا) اضافه شد. نتیجة نهایی با دستگاه Gel Documentation system CCD (CCD-Tab1 Kiagen-biotech ایران) بررسی و از آن عکس تهیه شد. از مارکرbp 100 فرمنتاز (Thermofisher آمریکا) برای شناسایی باند مورد نظر استفاده شد. آزمون PCR به‌عنوان گلداستاندارد در مقایسه با سایر نتایج استفاده شد.
آنالیزهای آماری
در مطالعة حاضر، با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخة 19 داده‌های به‌دست‌آمده بررسی و تجزیه‌وتحلیل آماری شد. برای این منظور از روش‌های آماری توصیفی (تعیین فراوانی، درصد و میانگین) استفاده شد. همچنین، آزمون آماری K2 برای مقایسة یافته‌های کیفی و تست مثبت مستقل برای مقایسة یافته‌های کمّی استفاده شد. در این مطالعه مقادیر p value در ژن‌های مختلف به‌دست آمد (مقدار ٠٥/0≥p معنادار در نظر گرفته شد).
یافته‌ها
در مطالعة حاضر، بیشترین سویه‌های استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین مربوط به نمونه‌های گرفته‌شده از بیماران بستری در بخش‌های اطفال و ICU جداسازی شد (شکل 1). از ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس به‌دست‌آمده 59 ایزوله به روش فنوتیپی دیسک دیفیوژن سفوکسیتین (30 میکروگرم) و اوگزاسیلین (1 میکروگرم) مقاوم به متیسیلین و 30 ایزولة حساس به متیسیلین شناخته شد (جدول 3).
با بررسی‌های مولکولی ایزوله‌های غربالگری‌شده، 50 ایزوله دارای ژن mecA بود (شکل 2). ایزوله‌های جمع‌آوری‌شده از نمونه‌های سواپ بینی و ادرار بیشترین فراوانی را از نظر حضور ژن mecA داشت. همچنین، نمونه‌های ادرار، خون و سواپ بینی از نظر ژن‌های qacA/B و smr بیشترین فراوانی را داشت. کمترین فراوانی در بین نمونه‌های به‌دست‌آمده از نظر حضور ژن‌های مورد مطالعه به نمونه‌های مایع مغزی- نخاعی و خلط اختصاص داشت (جدول 4).
برای بالابردن ضریب حساسیت در تشخیص ایزوله‌های بالینی استافلیوکوک اورئوس، از ژن 16sRNA استفاده شد. از 89 ایزولة تأییدشده به روش‌های بیوشیمیایی و با استفاده از تست‌های بیوشیمیایی، همة ایزوله‌ها این ژن را داشتند. برای پی‌بردن به ارتباط یا عدم‌ارتباط حضور ژن عامل مقاومت به متیسیلین و ژن‌های عامل مقاومت به بیوسایدها، بعد از تعیین هویت ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس، حضور ژن‌های srm و qacA/B بررسی (شکل 2، 3 و 4) و با استفاده از آنالیزهای آماری ارزیابی شد.
از میان 30 سویة حساس به متیسیلین و فاقد ژن mecA که از نظر فنوتیپی هم منفی گزارش شده بود، 9 ایزوله ژن qacA/B داشت و 3 ایزوله هم حامل ژن smr بود (جدول 3 و 4). علاوه‌بر این، در ایزوله‌هایی دارای ژن mecA و مقاوم به متیسیلین، 20 ایزوله ژن qacA/B و 11 ایزوله ژن smr داشت (جدول 3 و 4). با استفاده از آنالیز آماری K2 مقادیر p value به‌دست‌آمده برای ژن‌های mecA، qacA/B و smr به‌ترتیب 0033/0، 0019/0 و 0043/0 تعیین شد.
شکل 1. فراوانی ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس بر اساس بخش‌های جداشده از مراکز درمانی شهر زاهدان
جدول 3. فراوانی ایزوله‌های استافیلوکوک حساس به متیسیلین حامل ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها و استافیلوکوک‌های مقاوم به متیسیلین حامل ژن‌های مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها بر اساس نوع نمونة بالینی
|
|
استافیلوکوک اورئوس (89=n) |
ژن مورد مطالعه |
|
|
p value |
مقاوم به متیسیلین (59=n) |
حساس به متیسیلین (30=n) |
|
|
0033/0 |
50 |
0 |
mecA |
|
0019/0 |
20 |
9 |
qacA/B |
|
0043/0 |
11 |
3 |
smr |
|
شکل 2. نتیجة تکثیر ژن‌های mecAمربوط به عامل مقاومت به متیسیلین. چاهکهای 2 تا 6 مربوط به نمونه‌های حاوی ژن‌های mecA و داری وزن مولکولی 533 جفت باز، چاهک 1 کنترل منفی و چاهک M مارکر 100جفت بازی است. |
شکل 3. نتیجة تکثیر ژن‌های qacA/B مربوط به عامل مقاومت به دترجنت‌ها. چاهکهای2 تا 6 مربوط به نمونه‌های حاوی ژن‌های qacA/B و داری وزن مولکولی157 جفت باز، چاهک 1 کنترل منفی و چاهک M مارکر 50 جفت بازی است.
جدول 4. فراوانی ژن‌های عامل مقاومت به متیسیلین و عامل مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها در ایزوله‌های بالینی استافیلوکوک اورئوس
|
استافیلوکوک اورئوس (89=n) |
نمونه‌های بالینی |
|||||
|
استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین (59=n) |
استافیلوکوک اورئوس حساس به متیسیلین (30=n) |
|||||
|
smr (11=n) |
qacA/B (20=n) |
mecA (50=n) |
smr (3=n) |
qacA/B (9=n) |
mecA (30=n) |
|
|
2 |
7 |
19 |
0 |
4 |
11 |
کشت ادرار |
|
0 |
4 |
6 |
0 |
0 |
3 |
کشت خون |
|
6 |
8 |
11 |
1 |
2 |
6 |
سواپ بینی |
|
1 |
0 |
4 |
0 |
1 |
3 |
زخم |
|
3 |
1 |
6 |
2 |
2 |
1 |
کاتاتر |
|
0 |
0 |
4 |
0 |
0 |
5 |
خلط |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
مایع مغزی- نخاعی |
شکل 4. نتیجة تکثیر ژن‌های smrمربوط به عامل مقاومت به دترجنت‌ها. چاهکهای 2 تا 6 مربوط به نمونه‌های حاوی ژن‌های smrو داری وزن مولکولی 195 جفت باز، چاهک 1 کنترل منفی و چاهک M مارکر 50 جفت بازی است.
بحث
در این مطالعه، به بررسی ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها در سویه‌های استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین در سال 1394 در شهر زاهدان پرداختیم. شیوع سویه‌های استافیلوکوک اورئوس از سویی با فراوانی بالا مشاهده شد. حضور ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها و آنتی‌موان‌های چهار ظرفیتی را نیز در طیف گسترده‌ایی از این سویه‌های مقاوم شاهد بودیم. از طرفی، با استفاده از آنالیزهای آماری مشخص شد که بین ژن عامل مقاومت به متیسیلین و ژن‌های smr و qacA/B ارتباط معناداری وجود دارد، به‌طوری که بیشترین میزان ایزوله‌های دارای ژن‌های مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها، از ایزوله‌های استافیلوکوک‌های مقاوم به متیسیلین جداشد و تعداد زیادی از ایزوله‌های مورد آزمایش هر سه ژن مورد مطالعه را دارا بود. این در حالی بود که در بین ایزوله‌هایی که از نظر ژنوتیپی حساس به متیسیلین و فاقد ژن mecA بودند، تعداد بسیار کمی از ایزوله‌ها ژن‌های qacA/B و smr داشتند و هیچ یک از این ایزوله‌ها هر سه ژن را با هم نداشتند.
بیشترین میزان سویه‌های MRSA و دارای ژن‌های qacA/B و smr نمونه‌های ادراری و سواپ بینی بود. این امر نشان‌دهندة توزیع سویه‌های مقیم در بینی در بین سویه‌های مقاوم است. این نتایج با گزارش‌های نوروزی و همکاران [15] در تهران همخوانی داشت. در هر دو مطالعه، شیوع بالای ایزوله‌های حامل این ژن‌ها مشاهده شد. این در حالی است که ایزوله‌های استافیلوکوک اورئوس به‌طور طبیعی در قسمت بینی افراد مقیم است و حضور ژن‌های عامل مقاومت در بین این ایزوله‌ها را باید امری جدی در نظر گرفت [22].
گزارش نوگاچی و همکاران [3] از جداسازی سویه‌های مقاوم به متیسیلین و شوینده‌های آنتی‌موآن چهار ظرفیتی از نمونه‌های سواپ بینی با نتایج مطالعة حاضر همخوانی داشت. همچنین، نمونه‌های ادرار بیماران شامل بیشترین ایزولة دارای ژن‌های mecA، qacA/B و smr بود. این موضوع علاوه‌بر اینکه نشان‌دهندة حضور استافیلوکوک اورئوس در بین باکتری‌های عامل عفونت‌های ادراری است،گسترش قابل‌توجه ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌سپتیک‌ها در ایزوله‌های بالینی جداشده از عفونت‌های ادراری را نشان می‌دهد. این نتایج با مشاهدات اُتر و همکاران [6] در انگلیس همخوانی دارد. همچنین، نتایج به‌دست‌آمده از میزان بالای آلودگی بیماران بخش مراقبت‌های ویژه در مطالعة حاضر با بررسی‌های آن‌ها کاملاً همخوانی داشت، به‌طوری که بیش از 60 درصد از نمونه‌های این بخش حاوی ژن qacA/B و بیش از 30 درصد هم دارای ژن smr بودند.
حضور هم‌زمان ژن‌های qacA/B بیان‌کنندة ارتباط حضور این ژن‌ها با ژن عامل مقاومت به متیسیلین (mecA) بود. هورنر و همکاران [23] در مطالعه‌ای مروری وجود ارتباط بین ژن‌های عامل مقاومت به برخی آنتی‌بیوتیک‌ها و ژن‌های عامل مقاومت به برخی بیوسیدها را گزارش کردند.
در مطالعات لانگتین و همکاران [16] در کانادا، مک‌گان و همکاران [25] در آمریکا، و والی و همکاران [18] و نوگاچی و همکاران [26] در ژاپن بین ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌بیوتیک متیسیلین و ژن‌های عامل مقاومت به بیوسایدها ارتباطی گزارش نشد که با نتایج این مطالعه ناهمخوانی دارد. همچنین، در مطالعات ذکرشده فراوانی ژن smr بیش از qacA/B گزارش شده است که از این نظر هم با مطالعة حاضر هیچ‌گونه همخوانی ندارد. این ناهمخوانی در نتایج را می‌توان به اختلاف مناطق جداسازی‌شدة نمونه‌ها، شرایط آب‌وهوایی و جغرافیایی متفاوت، تفاوت وجود جهش‌های باکتریایی در نواحی مختلف و انتقالات ژنتیکی متفاوت در بین باکتری‌ها نسبت داد [24-26].
زمانتار و همکاران [28]، لی‌لاپورن و همکاران [27]، و سیجو و همکاران [29] در مطالعات جداگانه‌ای روی حضور ژن‌های عامل مقاومت به متیسیلین و بیوسایدها، فراوانی بالای ژن qacA/B را نسبت به ژن smr گزارش کردند. حضور بالای این ژن‌ها در نمونه‌های بالینی، به‌خصوص در نمونه‌های سواپ بینی و ادرار و کشت خون، بیان‌کنندة ظهور عفونت‌هایی است که بر پایة استافیلوکوک‌های اورئوس استوار شده است که علاوه‌بر داشتن ژن‌های عامل مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها، دارای ژن‌های مقاومت به ضدعفونی‌کننده‌ها نیز است. گستردگی این ژن‌ها در دنیا و ایران با سرعت بالایی در حال افزایش است [21]. با توجه به اینکه این ژن‌ها توانایی گردش بین‌سویه‌ای را نیز دارد، باید با اتخاذ تدابیری نخست از گسترش سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک جلوگیری کرد، سپس سویه‌های مقاوم به آنتی‌سپتیک‌ها را با شناسایی ژنتیکی کنترل کرد.
نتیجه‌گیری
پژوهش حاضر حـضور ژن‌های qacA/B و smr را در استافیلوکوکوس‌های اورئوس مقاوم به متیسیلین بررسی و ضرورت وجود توجه بیشتر و تحقیق گسترده‌تر در زمینة نوع، همچنین میزان مادة بیوسـایدی مصرفی در محصولات بیوسـایدی مـورد مـصرف گسترده را بیان می‌کند. همچنین، در بررسی حاضر ارتباط قابل‌توجهی بین مقاومت به QACs و مقاومت به متیسیلین به‌دست آمد. در نتیجه، حضور هر کدام از این شاخص‌های مقاومت ممکن است به گزینش مشترک این دو به‌دنبال درمان آنتی‌بیوتیکی یا به‌دنبال مصرف مواد ضدعفونی‌کنندة حاوی ترکیبات چهارتایی آمونیم منجر شود. در نهایت، حضور ژن‌های qac در میان جمعیت استافیلوکوک اورئوس به‌خصوص سویه‌های مقاوم به بتالاکتام‌ها و توانایی آن‌ها در گسترش مقاومت تشان و احتمال بروز مقاومت متقاطع با برخی آنتی‌بیوتیک‌ها، اهمیت سازوکارهای اتخاذشده در کنترل عفونت مؤثر و استفاده از مواد بیوسایدی در غلظت توصیه‌شده را بیش از گذشته بیان می‌کند.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله لازم می‌دانند از کارشناسان آزمایشگاه میکروبشناسی دانشکدة پزشکی زاهدان و مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی- گرمسیری تشکر کنند که ما را در انجام این طرح یاری کردند. این مقاله بخشی از طرح مصوب دانشگاه علوم پزشکی زاهدان با کد کمیتة اخلاق به شمارة 7152 است.
)