نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه زیست شناسی، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران
چکیده
اهدافشیف‌بازها به‌دلیل خواص آنتی‌اکسیدانتی، ضدویروسی و ضدباکتریایی در سال‌های اخیر توجهات زیادی را به‌خود جلب کرده است. آنتی‌اکسیدان‌ها از واکنش رادیکال‌های آزاد جلوگیری می‌کند و به کاهش بیماری‌های قلبی- عروقی، سرطان‌ها جزآن می‌انجامد. باکتری‌ها خود را به سیستم‌های دفاعی مختلفی مجهز کرده‌اند که بتوانند در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها مقاومت کنند. از این‌رو، گسترش فاکتورهای آنتی‌میکروبی با سازوکارهایی که تأثیر بیشتری داشته باشد ضروری است. در این تحقیق به بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌میکروبی کمپلکس شیف‌باز N,Nˊ-dipyridoxyl (1,2 diaminobenzene) Cu2+ پرداخته‌ایم.
مواد و روش‌هاپس از سنتز کمپلکس شیف‌باز، ارزیابی فعالیت آنتی‌رادیکالی این کمپلکس با انجام آزمون‌های 1،1-دیفنیل-2-پیکریل- هیدرازیل ((DPPH، 2،2-آزینو بیس (3-اتیل بنزوتیازولین 6- سلفونیک اسید) (ABTS) و هیدروکسیل و به‌منظور بررسی خواص آنتی‌میکروبی از دو باکتری به روش دیسک دیفیوژن استفاده شد.
یافته‌ها 1،1-دیفنیل-2-پیکریل- هیدرازیل (DPPH)(IC50 = 0.1 mg/ml)، 2،ʹ2-آزینو بیس (3-اتیل بنزوتیازولین 6-سلفونیک اسید) (ABTS)(IC50= 0.11mg/ ml) و هیدروکسیل (IC50=0.14mg/ml)(OH°) جذب‌کنندة رادیکال عمل کرده است. در غلظت g/mlμ250 باکتری خاصیت آنتی‌میکروبی از خود نشان داد.
نتیجه‌گیرینتایج به‌دست‌آمده از این پژوهش نشانگر این است که کمپلکس شیف‌باز مس دار دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی است و در آزمون آنتی‌میکروبی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در مقایسه با اشرشیاکلی حساسیت بیشتری نسبت به شیف باز از خود نشان داد (حدود 1 میلی‌متر).
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
investigation antiradical activity and properties antibactrial complex of cu(II) schiff base
نویسندگان [English]
- Soheyla Yadamani
- Ali Neamati
- Masoud Homayouni Tabrizi
- Samira Yadamani
چکیده [English]
Background: Schiff bases have attracted great attention in recent years due to their antioxidant, antiviral and antibacterial properties. Antioxidants prevent free radical reactions and leading to decrease in cardiovascular disease, cancers, etc. Bacteria exploited variety of defense systems so they can resist against antibiotics. Therefore, it is necessary to develop antimicrobial factors with more effective mechanisms. In present study, antioxidant and antimicrobial properties of copper Schiff base complex N’-N1 dipirodoxil-1-2 diaminobenzene has been studied.
Materials and methods: After Synthesis of Schiff base complex, evaluation of antiradical activity of this complex was performed using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) and hydroxyl (OH ̊) tests. In order to study antimicrobial properties, disk diffusion test was done using bacteria.
Results: Schiff base complex acted as scavengerof 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) (IC50 = 0.1 mg/ml), 2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (IC50 = 0.11 mg/ml) and hydroxyl radicals (OH ̊) (IC50 = 0.14 mg/ml). Antimicrobial effects of this complex against two bacteria were seen at the concentration of 250 µg/ml.
Conclusion: Findings of this study indicate that copper Schiff base complex has antioxidant activity and in antimicrobial test Staphylococcus aureus is more sensitive than Escherichia coli.
Keywords: Copper Schiff base; Antiradical Activity; DPPH; Antimicrobial
کلیدواژه‌ها [English]
- Copper Schiff base
- Antiradical Activity
- DPPH
- Antimicrobial
مقدمه
در دو دهة اخیر، شیف‌بازها در شیمی کئوردیناسیون فلزات واسطه و نیز فلزات گروه اصلی نقش کلیدی بازی می‌کند [1 و 2]. این لیگاندها از مسیرهای سنتزی مستقیم با درجة خلوص بالا و بازده مناسب حاصل می‌شود [3]، به‌راحتی با بیشتر یون‌های فلزات واسطه کمپلکس‌های پایداری ایجاد می‌کند [4] و دستة حیاتی ترکیبات در شیمی دارویی است که اهمیت شیمی‌درمانی و کاربرد ضدباکتریایی آن به اثبات رسیده است [5 و 6]. شیف‌بازها کاربردهای متنوعی در زمینه‌های بسیاری دارد، نظیر علوم بیولوژیکی [7]، شیمی مواد [8]، شیمی آلی [9] و شیمی معدنی [10]. شیف‌بازهای دارای فعالیت زیستی داروی ضدباکتری [11]، آنتی‌اکسیدانتی [12]، ضدسرطان [13] و ضدالتهاب [14] به‌کار می‌رود. مس عنصری ضروری با اهمیت اکسایشی و فعالیت زیستی ضروری در سوخت‌وساز انسان است و به شکل یونی در سیستم‌های بیولوژیکی دیده نمی‌شود. بنابراین، اندازه‌گیری مس در بدن به شکل کمپلکس‌های دارای اجزای آلی بررسی شده است [15].
رادیکال‌های آزاد قادر است به مولکول‌های سیستم بیولوژیکی بدن آسیب وارد کند و باعث بروز بیماری‌های زیادی در موجودات زنده، به‌خصوص انسان، شود [16]. طبیعت با فرایندهای دفاعی آنتی‌اکسیدانی این عوامل را خنثی یا آثار مضر آن را کاهش می‌دهد. در شرایط طبیعی، بین انواع فعال اکسیژن و ایجاد رادیکال‌های آزاد و سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدان تعادل وجود دارد؛ با اینکه اگر تولید رادیکال‌های آزاد افزایش یابد یا قدرت دفاعی آنتی‌اکسیدان کاهش یابد، زمینه برای ایجاد صدمات به‌وسیلة رادیکال‌های آزاد زیاد می‌شود که به این حالت استرس اکسایشیی گفته می‌شود [17].
در چنین شرایطی برای متعادل‌سازی واکنش‌هایی که در آن رادیکال‌های آزاد تولید شده وجود آنتی‌اکسیدان‌ها ضروری است [18]. آنتی‌اکسیدان‌ها داروی ضدسرطانی، درمان بیماری‌های قلبی- عروقی، ضدپیری و بیماری‌های مخرب اعصاب مانند پارکینسون استفاده می‌شود. علاوه‌بر این، مصرف خوراکی بعضی آنتی‌اکسیدان‌ها مکمل تقویت سیستم ایمنی و افزایندة انرژی است [19].
افزایش میزان مرگ مرتبط با بیماری‌های عفونی مستقیماً به باکتری‌ها وابسته است که مقاومت متعددی به آنتی‌بیوتیک‌ها نشان می‌دهند. علت اصلی این مشکل نبود درمان‌های مؤثر است [20]. توسعة عوامل آنتی‌باکتریایی جدید با سازوکارهای عمل مؤثرتر و نو قطعاً نیاز ضروری پزشکی است [21].
مواد و روش‌ها
تهیة کمپلکس شیف‌باز
همان‌طور که در شکل 1 مشاهده می‌شود، در این پژوهش از شیف‌باز N,Nˊ-dipyridoxyl(1,2 diaminobenzene)Cu2+با فرمول شیمیایی C24H28CuN4O6، جرم مولکولی 75/531 گرم بر مول استفاده شده است.
روش سنتز شیف‌باز به این صورت است که محلولی از 1 میلی‌مول نمک فلزی Cu(CH3COO)2.H2O در ml 6 متانول قطره‌قطره به محلول متانولی از 1 میلی‌مول لیگاند N و-N' دی‌پیریدوکسیل (1و2- بنزن دی‌آمین) افزوده شد. برای 6 ساعت، مخلوط در دمای 30 درجة سانتی‌گراد به‌هم خورد. رسوبات به‌دست‌آمده صاف و با کمی متانول سرد شستشو داده شد. رسوبات را در آون در دمای حدود 60 درجة سانتی‌گراد قراردادیم تا خشک شود.
ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی شیف‌باز مس‌دار با روش پاکسازی رادیکال (DPPH)
DPPH رادیکال آزاد نــاپایداری است کــه در وجــود آنتی‌اکســیدان‌ها در نــمونه‌های زیــستی خنثی می‌شود.
(1) DPPH + RH →DPPH – H +R
رادیکال آزاد DPPH، در محیط اتانول جذب در 517 نانومتر رنگ ارغوانی ایجاد می‌کند. در صورتی که این رادیکال خنثی شود، رنگ ارغوانی کاهش می‌یابد و به رنگ زرد کم‌رنگ تغییر می‌کند. بنابراین، توانایی خنثی‌سازی رادیکال DPPH با کاهش جذب متناسب است؛ به‌معنای دیگر، قدرت آنتی‌اکسیدانی نمونه مورد نظر است. نتایج به‌صورت درصد خنثی‌سازی یا مهار رادیکال DPPH در نمونه بیان می‌شود (رابطة 2) [22].
(2) DPPH =
قابلیت خنثی‌سازی رادیکال DPPH طبق روش Brand-Eilliams و همکاران بررسی شده است [23].
بررسی قابلیت حذف رادیکال (ABTS)
برای انجام این آزمایش از روش ری و همکاران استفاده شد [24]. رادیکال کاتیون ABTS نسبت به رادیکال DPPH فعال‌تر است و واکنش‌دهندگی آن با آنتی‌اکسیدان حدود 1 دقیقه طول می‌کشد. به‌همین دلیل در سنجیدن فعالیت آنتی‌رادیکالی از آن استفاده زیادی می‌کنند. در این آزمایش، نخست رادیکال کاتیون پایدار ABTS با اکسایش ABTS به‌وسیلة پتاسیم پرسولفات، تولید می‌شود. این رادیکال کاتیونی رنگ سبز-آبی و جذب در طول‌موج 734 نانومتر دارد و به‌واسطة تعیین میزان کاهش جذب می‌توان به کاهش میزان این رادیکال کاتیونی پی‌برد که شاخصی از فعالیت آنتی‌رادیکالی ترکیبات مورد نظر است [25].
(3)
اندازه‌گیری اثرگذاری شیف‌باز در حذف رادیکال‌های هیدروکسیل
برای فعالیت حذف رادیکال‌های هیدروکسیل از روش لیون و همکاران استفاده شد [26]. نخست، مخلوطی از 600 میکرولیتر فنانترولین (غلظت 5 میلی‌مولار)، 600 میکرولیتر سولفات آهن (غلظت 5 میلی‌مولار)، 600 میکرولیتر EDTA (غلظت 15 میلی‌مولار) و 400 میکرولیتر بافر سدیم فسفات (غلظت 2/0 مولار) و 4/7pH= آماده شد. سپس، 600 میکرولیتر از نمونة کمپلکس شیف‌باز (غلظت 1 میلی‌گرم/ میلی‌لیتر) به محلول و در آخر 800 میکرولیتر آب‌اکسیژنه اضافه‌شد. مخلوط به‌مدت یک ساعت در دمای 37 درجة سانتی‌گراد انکوبه و جذب محلول در محدودة 536 نانومتر اندازه‌گیری شد [27].
درصد فعالیت حذف رادیکال های هیدروکسیل =
(AS – A0) × 100/ (AC –A0)(4)
آزمون ضدمیکروبی
آزمایش در سه تکرار انجام و از دو باکتری استافیلوکوکوس اورئوس )گرم مثبت((ATCC 1112) و اشرشیاکلی )گرم منفی (ATCC 1330)) استفاده شد.
برای تهیة دیسک آنتی‌بیوتیکی از دیسک بلانک استفاده شد. دیسک‌ها با سه غلظت 100، 200، 250 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد. هر طرف دیسک با 15 میکرولیتر از محلول آغشته شد. با کمک سوآباستریلاز سوسپانسیون باکتریایی روی محیط مولرهینتون‌آگار کشت یکنواخت داده شد .دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی با استفاده از پنس استریل و با فواصل استاندارد (5/1 سانتی‌متر از لبة پلیت و 4/2 سانتی‌متر فاصلة مرکز دو دیسک مجاور) روی سطح محیط قرار داده شد. پلیت‌ها در انکوباتور 33 درجة سانتی‌گراد در شرایط هوازی به‌مدت 24 ساعت قرارگرفت. بعد از این مدت قطر هالة عدم‌رشد هر آنتی بیوتیک بر حسب میلی‌متر با استفاده از خط‌کش اندازه‌گیری شد [28]. برای تأیید آزمایش‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی، آنتی‌بیوگرام روی دیسک آنتی‌بیوتیکی جنتامایسین (به‌عنوان شاهد) انجام شد.
یافته‌ها
فعالیت آنتی‌اکسیدانتی و آنتی‌میکروبی شیف‌باز مس N1-N' دی‌پیریدوکسیل-1-2 دی‌آمینوبنزن ارزیابی شد. در این پژوهش، بررسی فعالیت رادیکال‌های DPPH، ABTS و هیدروکسیل بررسی شد. شکل 2 نشانگر فعالیت حذف رادیکال DPPH است. با افزایش غلظت شیف‌باز، میزان حذف رادیکال‌ها افزایش یافت و IC50 (غلظتی که در آن شیف‌باز 50 درصد از رادیکال‌های آزاد را به‌صورت احیا درمی‌آورد) در این تست mg/ml 1/0 به‌دست آمد. شکل 3 فعالیت جذب رادیکال ABTS را نشان می‌دهد. مقدار حذف رادیکال‌ها متناسب با افزایش غلظت شیف‌باز نیز افزایش یافت. در این آزمایش IC50، mg/ml 11/0 محاسبه شد. در هر دو تست از گلوتاتیون احیا (GSH) به‌عنوان آنتی‌اکسیدان استاندارد استفاده شد، IC50کمتر از mg/ml 015/0 است. همچنین، شکل 4 نشان‌دهندة فعالیت حذف رادیکال به روش هیدروکسیل است. هر چه غلظت شیف باز افزایش پیدا کرد، حذف رادیکال هم زیاد شد. از اسکوربیک اسید با IC50کمتر از mg/ml 015/0 به‌عنوان آنتی‌اکسیدان استاندارد استفاده شد. شکل‌های 5 و 6 بیانگر آزمون آنتی‌میکروبی است که به‌روش دیسک دیفیوژن انجام شد. همان‌طور که در شکل 5 و 6 مشخص است باکتری گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس) تأثیر بیشتری نسبت به باکتری گرم منفی (اشرشیاکلی) از خود نشان داد؛ به‌عبارتی، به شیف‌باز حساسیت بیشتری دارد. جدول 1 قطر هالة عدم‌رشد باکتری با شیف‌باز را بیان می‌کند.
شکل 1. ساختار کمپلکس شیف‌باز N,N-dipyridoxyl(1,2 diaminobenzene) Cu2+سنتزشده و مورد استفاده در این پژوهش
شکل 2. درصد مهار رادیکال DPPHبا شیف‌باز مس‌دار. در این تست از گلوتاتیون به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.
شکل 3. درصد مهار رادیکال ABTS با شیف‌باز مس‌دار. در این تست از گلوتاتیون به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.
شکل 4. درصد مهار رادیکال هیدروکسیل با شیف‌باز مس‌دار. در این تست از اسکوربیک اسید به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.
شکل 5. مهار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (گرم مثبت) با شیف‌باز مس‌دار که به روش دیسک دیفیوژن بررسی شد.
شکل 6. مهار رشد باکتری اشرشیاکلی (گرم منفی) با شیف‌باز مس‌دار که به‌روش دیسک دیفیوژن بررسی شد.
جدول 1. تأثیر شیف‌باز مس‌دار بر دو باکتری گرم منفی و گرم مثبت به‌روش دیسک دیفیوژن به‌منظور تعیین میزان مهار رشد باکتری‌ها در شیف‌باز
|
غلظت شیف‌باز (µg/ml) |
میزان خاصیت آنتی‌میکروبی (mm) |
|
|
اشرشیاکلی |
استافیلوکوکوس اورئوس |
|
|
100 |
بی‌اثر |
بی‌اثر |
|
200 |
8 |
9 |
|
250 |
8 |
9 |
بحث و نتیجه‌گیری
طبق نتایج حاصل از تست‌های آنتی‌اکسیدانتی (DPPH، ABTS و هیدروکسیل) می‌توان گفت که کمپلکس شیف‌باز مس‌دار N,Nˊ-dipyridoxyl (1,2 diaminobenzene) Cu2+فعالیت آنتی‌اکسیدانی دارد. استرس اکسایشی با بیماری‌هایی نظیر سرطان، نارسایی قلبی، پارکینسون و آلزایمر در ارتباط است. در نتیجه، شناسایی و تولید آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی و سنتزی برای جلوگیری از استرس اکسایشی و آثار مخرب آن ضروری است.
در مطالعة مشابهی، هاق و همکاران با سنتز فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدتوموری و حفاظت از DNA ترکیبات شیف‌بازهای آلی حاوی فروسن را ارزیابی کردند. این مطالعه نشان داد که تمام اجزا فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی، ضدتوموری و حفاظت از DNA قوی دارند [29]. لیگاندهای شیف‌باز از نظر خواص دارویی مانند ضدباکتری، ضدویروس، ضدقارچ و ضدتومور بسیار جالب توجه است [30 و 31]. شیف‌باز نیز به‌طور بالقوه داروی ضدسرطانی است و زمانی که از آن در تهیة کمپلکس‌های فلزی استفاده شود خاصیت ضدسرطانی این کمپلکس‌ها در قیاس با لیگاند آزاد تقویت می‌شود [32]. طیف گستردة کاربرهای طبی این اجزا بررسی شد و در برخی از آن‌ها معلوم شد که به‌صورت عوامل تشخیص بالینی و نیز در شیمی‌درمانی مفید است [33]. شیف‌باز کمپلکس مس (II) پتانسیل زیادی در فعالیت ضدتکثیری و ضدباکتریایی دارد [34].
در مطالعة دیگری، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌فلامنتری یک‌سری از ترکیبات دارای مس با روش‌های رادیکال DPPH، هیدروکسیل و سوپر اکسید انجام شد [35]. کمپلکس شیف‌باز Ruthenium(III) S-methylisothiosemicarbazone از نظر خاصیت آنتی‌اکسیدانی با روش‌های DPPH، هیدروژن پراکسید، رادیکال هیدروکسیل و رادیکال اکسید نیتریک ارزیابی شد و نشان داد خاصیت آنتی‌اکسیدانی عالی دارد [36]. همچنین، در مطالعة حاضر، طبق بررسی با آزمون آنتی‌میکروبی، خاصیت آنتی‌میکروبی شیف‌باز مس‌دار تأیید شد. شیف‌بازها عوامل امیدبخش آنتی‌باکتریایی است. برای مثال، N-(salicylidene)-2-hydroxyaniline علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV مؤثر است [37]. اخیراً طی مطالعه‌ای سنتز و فعالیت آنتی‌میکروبی یک رشته از شیف‌بازهای مشتق‌شده از تغلیظ 5-کلرو-سالیسیل آلدهید و آمین‌های اولیه گزارش شده است [38]. همچنین، در پژوهشی دیگر شیف‌باز مشتق‌شده از ایساتین و دارای فعالیت آنتی‌باکتریایی گزارش شده است [39]. امیری و همکاران خواص آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌میکروبی شیف‌باز مشتق‌شده از تیوسمی‌کاربازون را ارزیابی کردند [40].
تشکر و قدردانی
این مقاله، حاصل پایان‌نامة دورة کارشناسی‌ارشد سهیلا یدامانی است که در سال 1394به تصویب رسید و با حمایت دانشگاه آزاد مشهد اجرا شده است. بدین‌وسیله نویسندگان مقاله از کارشناسان آزمایشگاه بیوشیمی و میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد کمال تشکر و قدردانی را دارند که در فراهم‌آوردن امکانات این تحقیق همکاری لازم را مبذول داشتند.
)