نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسنده
استادیار فیزیولوژی ورزشی، گروه تربیتبدنی دانشکدة علوم انسانی، دانشگاه لرستان، ایران
چکیده
اهداف: فاکتور رونویسی med 13بر پاسخ عضلة اسکلتی به محرکهای القاکنندة سازگاری عضلانی تأثیر دارد. هدف این پژوهش بررسی تأثیر برنامة فعالیت استقامتی بر بیان ژن med 13 عضلات اسکلتی تند و کند انقباض بود.
مواد و روشها: آزمودنیهایی این پژوهش چهارده رت نر نژاد ویستار بودند که تحت شرایط استاندارد بهمدت چهار هفته قبل از شروع پروتکل تمرینی نگهداری شدند. سپس، بهصورت تصادفی به دو گروه کنترل و تجربی تقسیم شدند. گروه تجربی برنامهای استقامتی (14 هفتهای) را روی نوارگردان اجرا کرد. 48 ساعت پس از پایان آخرین جلسة تمرینی، نمونهها بیهوش و تشریح شدند. عضلة نعلی و عضلة بازکنندة بلند انگشتان پا خارج شد. با استفاده از روش Real time-PCR میزان بیان ژن med 13دو عضله اندازهگیری شد. در پایان با استفاده از آزمون آماری t اطلاعات بهدستآمده ارزیابی شد.
یافتهها: نتایج این تحقیق نشان داد فعالیت استقامتی موجب افزایش معنادار بیان ژن med 13عضلة نعلی میشود، اما تأثیر معناداری بر بیان این ژن در عضلة بازکنندة بلند انگشتان ندارد.
نتیجهگیری: علیرغم فعالیت استقامتی یکسان (مدت و شدت)، میزان بیان این ژن در عضلات تند و کند انقباض متفاوت بود که احتمالابه تفاوت حساسیت عضلات به هورمون تیروئید برمیگردد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The difference of med 13 gene expression of slow and fast twitch skeletal muscles due to endurance activity
نویسنده [English]
- Mohammad Fathi
Assistant Professor, Physical Education Department, Faculty of Humanities, Lorestan University, Iran
چکیده [English]
Background & Objective: Med 13 transcriptional factor effects on skeletal muscle response related to stimuli inducing muscular adaptation. The aim of this research was to study the effects of an endurance activity program on med 13 gene expression in slow and fast twitch skeletal muscles.
Materials and Methods: The subjects of this study were 14 wistar rats which were housed four weeks under controlled conditions before of start of protocol. Then they were randomly assigned to control and experimental groups. The experimental group performed an endurance activity program (fourteen weeks) on motorized treadmill. They were anesthetized and sacrificed 48 hours after the end of the last session of endurance activity program. The soleus and extensor digitorum longus muscles were removed. Using real time RT-PCR method, the rate of expression levels of med 13 gene determined. Finally, by using t-test, the collected data were evaluated.
Results: The results of this research showed, physical activity significantly increase the expression of med 13 gene in soleus muscle but has no effect on expression of this gene in extensor digitorum longus muscles.
Conclusions: Despite the same endurance activity (duration and intensity), the rate of med 13 gene expression in fast and slow twitch muscles was difference which possibly return to difference of these muscles sensitivity to thyroid hormone.
کلیدواژهها [English]
- endurance activity
- extensor digitorum longus muscle
- med 13 gene
- soleus muscle
مقدمه
هورمون تیروئید یکی از مهمترین هورمون درونریز است که در کنترل سوختوساز، رشد و تمایز سلولها، بهخصوص سلولهای عضلة اسکلتی، نقش مهمی ایفا میکند. از طرفی، دیگر عضلات اسکلتی جزو بزرگترین اهداف هورمونهای تیروئیدی است [1]، بهخصوص عضلاتی که بیشتر درگیر انقباضاند [2]. پژوهشها نشان دادهاند که کاهش میزان هورمون تیروئید موجب تغییر در فنوتیپ عضله میشود و شرایطی را در عضله ایجاد میکند که مشابه آن در عضلاتی اتفاق میافتد که در معرض تمرینات استقامتی قراردارند و به افزایش تارهای نوع کند در این عضلات میانجامد [3].
مشخص شده است که افزایش میزان هورمون تیروئید به کاهش تارها نوع کند و افزایش تارهای نوع تند حتی در عضلات بسیار کند انقباض، مانند عضلة نعلی و عضلة قلب، میانجامد. این تغییر حتی در سطح رونویسی هم قابلردیابی است [4]. این پژوهشها نشان دادهاند که این تغییرات به افزایش و کاهش زنجیرهای سنگین میوزین نوع I و نوع IIa در عضلات اسکلتی میانجامد. سیستم عضلانی در مواجه با محرکهای گوناگون، از جمله فعالیت بدنی، متناسب با نوع آن سازگار میشود [5، 6] که این سازگاریها با تغییرات ژنی در سطح رونویسی و پسرونویسی نیز همراه است [7، 8] و با رشد ظاهری عضلات اسکلتی مشخص میشود [9] که با فعالسازی دستهای از ژنهای ساختاری کدکنندة اجزای دستگاه انقباضی، آنزیمها و گیرندههای سلولی [10] همزمان است. پژوهشهای زیادی در مورد تأثیر هورمون تیروئید بر عضلات اسکلتی صورت گرفته است و نتایج آن نشان داد که عضلات اسکلتی بهطور ویژهای تحت تأثیر این هورمون قراردارند [11، 12].
در ارتباط با هورمون تیروئید، مطالعات متعددی روی گیرندههای این هورمون نیز صورت گرفته است و به کشف یکی از پروتئینهای مرتبط با گیرندة این هورمون انجامید که در شکلگیری عضلات، همچنین حیات آنها نقش اساسی دارد. فاکتور مذکور را «زیرواحد 13 کمپلکس واسطه» (med 13) مینامند. آن را با نام [1]TRAP نیز میشناسند [13-15].
ژن med 13 در رتها روی کروموزم دهم قراردارد و دارای 7024 جفت باز است، که نقش مهمی در رونویسی دارد و در نقش فعالکنندة رونویسی، از گیرندة هورمون تیروئید سلول پستاندارن جدا شده است [16]. این فاکتور بیش از 25 پلیپپتید دارد و کمپلکس پروتئینی مرتبط با گیرندة هورمون تیروئیدی عمل میکند که بهوسیلة هورمون تیروئید، فعالیت رونویسی را فعال میکند [17]. این کمپلکس بهکارگیری و فعالسازی RNA pol II و دستگاه رونویسی عمومی در ژنهای هدف گیرندة هورمون هستهای[2] را تسهیل میکند [16]. همچنین، این کمپلکس همفعالکنندة[3] طیف گستردهای از فعالکنندهها[4]ست و زیرواحد (TRAP220) آن گیرنده تیروئید را با دیگر گیرندههای هستهای مرتبط میکند [17]. پژوهشها نشان دادهاند که این کمپلکس هم برای عملکرد بهینة گیرندة هورمون تیروئید و هم برای رشد و فرایند هموستازی موشهای بالغ ضروری است [17]. از آنجا که هم فعالیت بدنی و هم فاکتور med 13 نقش مهمی در عملکرد و شکلگیری عضلات دارند [12، 16، 18]، هدف این پژوهش بررسی تأثیر یک دوره فعالیت استقامتی بر بیان ژن med 13 عضلات اسکلتی تند و کند انقباض است.
مواد و روشها
آزمودنیهای این پژوهش )با کد 569-20/2/94) چهارده رت صحرایی نر نژاد ویستار بودند که اثر چهارده هفته فعالیت استقامتی بر بیان ژن med 13عضلات کند و تند انقباض آنها بهصورت تجربی ارزیابی شد. نخست، بیست 20 سر رت غیربالغ با وزن 20±113 گرم از انستیتو پاستور تهیه شد. شرایط مناسب آزمایشگاهی (دسترسی آزاد به آب و غذای مخصوص رت، چرخة روشنایی و تاریکی 12:12 ساعت، میانگین دما 3±22 درجة سانتیگراد) بهصورت یکسان در آزمایشگاه حیوانات برای همة آنها فراهم شد. بعد از رسیدن به بلوغ کامل وزن آنها به 24±231 گرم رسید. سپس، دورة آشناسازی (ده روزه، پنج جلسه) با فعالیت استقامتی (دویدن روی نوارگردان) برای همة آنها در نظر گرفته شد. بعد از پایان دورة آشناسازی، بهطور تصادفی به دو گروه (ده سر بهعنوان گروه شاهد و ده سر دیگر بهعنوان گروه تمرینی) تقسیم شدند. سه سر از رتهای گروه تمرینی نتوانستند تا پایان دورة تمرینی پروتکل را اجرا کنند. بنابراین، همراه با سه سر از رتهای گروه کنترل (بهطور تصادفی) از مطالعه حذف شدند. با حذف سه سر از رتهای گروه کنترل (بهطور تصادفی) تعداد نهایی آنها به چهارده سر (هفت سر شاهد و هفت سر تجربی) رسید.
پروتکل تمرینی
پروتکل فعالیت استقامتی ویژة رت با استفاده از منابع قبلی طراحی شد [19، 20]. پروتکل (چهارده هفته، هفتهای شش روز) گروه تمرینی عبارت بود از دویدن روی نوارگردان که سرعت و شیب و زمان آن قابلبرنامهریزی بود. هر جلسه با بخشی 5 دقیقهای با سرعت 12 متر در دقیقه برای گرمکردن شروع میشد. در جلسة نخست، بخش اصلی پروتکل 12 دقیقه بود. بهطور هفتگی، مدت زمان بخش اصلی پروتکل افزایش یافت (در هفته 1-3 هر روز 2 دقیقه به مدت زمان اجرای بخش اصلی پروتکل اضافه میشد)، بهطوری که در پایان روز 23 مدت بخش اصلی پروتکل به 50 دقیقه رسید که با احتساب 5 دقیقه گرمکردن و 5 دقیقه سردکردن، مدت زمان کلی 60 دقیقه بود. شدت تمرین با سرعت 20 متر در دقیقه شروع شد. سپس هر هفته 2 متر بر دقیقه به سرعت اضافه شد، بهطوری که در پایان هفتة ششم، سرعت به 30 متر در دقیقه رسید. در نهایت، طی هفتههای 7 تا 10 به تدریج 5 درجه شیب (ابتدای هر هفته تقریباً 2/1 درجه شیب) نیز اضافه شد. این پروتکل (60 دقیقه دویدن شامل 5 دقیقه گرمکردن با سرعت 12 متر در دقیقه، 50 دقیقه دویدن با سرعت 30 متر در دقیقه، با شیب 5 درجه بهعنوان بخش اصلی پروتکل، و در نهایت 5 دقیقه دویدن با سرعت 9 متر در دقیقه به عنوان بخش سردکردن) تا پایان هفتة چهارده حفظ شد. پروتکل بین ساعت 5 تا 7 بعدازظهر هر روز اعمال میشد.
در نهایت، 48 ساعت پس از پایان آخرین جلسة تمرینی، رتها با ترکیبی از کتامین (80 میلیگرم بهازای هر کیلوگرم وزن بدن) و زایلازین (10 میلیگرم بهازای هر کیلوگرم وزن بدن) بیهوش شدند. بعد از بیهوشی کامل (بهطوری که به تحریک اعمالشده پاسخ ندهد)، عضلات نعلی و EDL آنها تحت شرایط استریل خارج شد. بافتهای مورد نظر بلافاصله در میکروتیوبهایی با حجم 5/1 میلیلیتر با برچسب متناسب با بافت، رت و ساعت تشریح جاسازی و وارد تانک نیتروژن شد. بعد از اتمام تشریح و تا شروع هموژن بافتها، همة آنها در دمای 80- سانتیگراد نگهداری شدند.
استخراج RNA از بافت
برای استخراج RNA از بافتهای هموژنشده با استفاده از نیتروژن مایع و هاون، به 100 میلیگرم از بافت داخل میکروتیوب، 1 میلیلیتر ترایزول (Invitrogen) اضافه شد و پس از مخلوطکردن کامل (پیپتاژکردن) بهمدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری (انکوبه) و سپس 2/0 میلیلیتر به آن کلروفرم سرد اضافه و پس از پیپتاژ (15 ثانیه) حدود 2 تا 3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. در ادامه، میکروتیوبها به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجة سانتیگراد با 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ (شرکت eppendorff) شد. سپس، مایع رویی بهدقت برداشته و به میکروتیوب RNAase free انتقال داده شد (از این مرحله به بعد با سرسمپلر فیلتردار کار شد). سپس 5/0 میلیلیتر ایزوپروپانول سرد اضافه شد و بعد از همزدن ملایم در دمای 20- باقی ماند (overnight). روز بعد، میکروتیوبها به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجة سانتیگراد با 12000 دور در دقیقه مجدداً سانتریفیوژ شد. در این مرحله رسوب سفید رنگی در ته اکثر میکروتیوبها مشهود بود. با سمپلر (شرکت eppendorff) مایع رویی با دقت خارج و 1 میلیلیتر اتانول خالص سرد به آن اضافه شد. بعد از تکاندادن مختصر به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه با 7500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. در ادامه، مایع رویی بهدقت تخلیه و 10 دقیقه فرصت داده شد تا باقیماندة اتانول تبخیر و داخل میکروتیوب خشک شود. بعد از این مرحله 50 لاندا آب تزریقی به هر نمونه اضافه شد و چند بار به آرامی پیپتاژ صورت گرفت. در پایان، غلظت و نسبت جذبی نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (شرکت Eppendorff) ارزیابی شد. نسبت جذبی 280/260 نانومتر در تمام نمونهها بین 6/1 تا 8/1 بود. غیر از مراحلی که نیاز بود میکروتیوبهای حاوی مواد سانتریفیوز یا ورتکس شوند، تمام مراحل کار زیر هودی انجام میشد که از قبل آماده شده بود ( استریلشده با الکل 75 درصد و نور UV).
سنتز cDNA
برای رونویسی RNA به cDNA از کیت شرکت ScientificThermo با Cat # K1621 استفاده شد. نخست مطابق دستورالعمل کیت، مقداری مشخصی از RNA هر نمونه، Reaction buffer، dNTP mix، Random hexamer، مسترمیکس و آب مقطر (رساندن به حجم 20 لاندا) در داخل میکروتیوب برای هر نمونه ترکیب میشد. سپس، برای رونویسی به cDNA طبق دستورالعمل کیت، دمای دستگاه ترموسایکلر بهصورت زیر برنامهریزی و اجرای میشد. انکوبهشدن در دمای 25 درجة سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه، سپس 60 دقیقه در دمای 42 درجه و در نهایت با افزایش دما به 70 درجة سانتیگراد و مدت 5 دقیقه واکنش پایان یافت. تمام مراحل مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. ترموسایکلر مورد استفاده در این مرحله متعلق به شرکت Eppendorff بود.
ارزیابی بیان ژن
نخست، پرایمر ژنها با نرمافزار Oligo 7 طراحی و توسط شرکت Gene Biotech سنتز شد. قبل از ارزیابی نهایی بیان ژن، طبق دستورالعمل تکنیک PCR Real Time نیاز بود که میزان کارایی ژن رفرنس[5] (gapdh) و ژن هدف (med 13) بررسی شود. مشخص شد میزان کارایی این دو ژن در بالاترین حد، یعنی 1، بود. در ادامة ارزیابی بیان ژن، از تکنیک Real Time PCR (one step) و دستگاه شرکت آپلاید بایوسیستم[6] استفاده شد. سایبرگرین مسترمیکس[7] استفادهشده در این مرحله متعلق به شرکت تاکارا با Cat # RR820L بود. طبق دستورالعمل کیت و بررسی میزان کارایی ژن رفرنس و هدف، برای نمونهای 10 لاندایی ترکیبی از مسترمیکس (5 لاندا) پرایمر (1 لاندا)، cDNA (1 لاندا) و آب مقطر (3 لاندا) در نظر گرفته شد و میزان بیان ژن با استفاده از روش نسبی ارزیابی شد. در هر Run (40 سیکلی) نمونهای بهعنوان کنترل منفی برای تعیین آلودگی master mix در نظر گرفته شد (طبق دستورالعمل شرکت آپلاید بایوسیستم نباید CT آن کمتر از 35 باشد). کنترل داخلی (gapdh)، کنترل مثبت (گروه کنترل) و med 13 همزمان (در یک Run) بهصورت دوتایی[8] ارزیابی شد. بعد از بهدستآوردن CT دوتایی برای هر نمونه و محاسبة میانگین آنها محصول Real time وی ژل آگاروز 1/8 درصد برده شد. بعد از انتقال اطلاعات به نرمافزار اکسل، طبق فرمول ctΔΔ2- میزان بیان ژن med 13محاسبه شد [21]. مشخصات پرایمرهای استفادهشده در جدول 1 آمده است. ژن رفرنس مطابق تحقیقات انجام شده است [22].
جدول 1. مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در پژوهش
اندازة محصول |
رفرنس توالی در سایت NCBI |
توالی 5-3 |
|
نام ژن |
74 |
NM_017008.4 |
AACCCATCACCATCTTCCAG |
F |
ژن gapdh |
CACGACATACTCAGCACCAG |
R |
|||
139 |
NM_001107035.1 |
AGATGTACTCGGTGTTTGGC |
F |
ژن Med 13 |
GCCATTCTCCCATACTCCATC |
R |
تجزیهوتحلیل دادهها
دادههای بهدستآمده از دستگاه Real Time PCR که بهصورت [9]CT (میانگین CT برای هر نمونه) بود [23-25]، با استفاده از نرمافزار اکسل به ctΔΔ تبدیل شد. سپس، با استفاده از فرمول ctΔΔ2- اعداد نهایی بهدست آمد [26]. با انتقال این اعداد به نرمافزار SPSS، نخست نرمالبودن توزیع دادهها با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk ارزیابی و مشخص شد که دادهها توزیع طبیعی دارند. بعد از تعیین نرمالبودن، برای تعیین اختلاف میانگینها از آزمون t استفاده شد.
نتایج
نتایج آزمون t (693/0t =) نشان داد، در اثر چهارده هفته فعالیت استقامتی، میزان بیان ژن med 13در عضلة تندانقباض، یعنی EDL، تغییر معناداری (514/0P=) نمیکند، اما نتایج آزمون t مشخص کرد (76/7t=) که فعالیت استقامتی بهمدت چهارده هفته موجب افزایش معنادار (001/0P=) بیان ژن med 13در عضلة نعلی میشود.
[1]. Thyroid Hormone Receptor (TR) Associated Protein
[2]. nuclear hormone receptor target genes
[3]. coactivator
[4]. activators
[5]. housekeeping
[6]. Applied Biosystem
[7]. SYBR green master mix
[8]. duplicate
[9]. Cycle Threshold
شکل 1. مقایسة بیان ژن med 13 در عضلة EDL گروه کنترل و تجربی با استفاده از Real Time Pcr که بعد از پایان کار دستگاه Real Time Pcr محصول آن روی ژل آگاروز و الکتروفورز برده شد. باندها منطبق بر نمودارها از راست به چپ نشاندهندة ژن gapdh، ژن med 13 گروه تجربی و ژن med 13 گروه کنترل است.
شکل 2. مقایسة بیان ژن med 13 در عضلة نعلی گروه کنترل و تجربی با استفاده از Real Time Pcr که بعد از پایان کار دستگاه Real Time Pcr محصول آن روی ژل آگاروز و الکتروفورز برده شد. باندها منطبق بر نمودارها از چپ به راست نشاندهندة ژن gapdh، ژن med 13 گروه کنترل و ژن med 13 گروه تجربی است
**= تفاوت میانگین گروهها (تجربی و کنترل) در سطح 01/0P≤
بحث
نتایج این پژوهش نشان داد که فعالیتهای استقامتی موجب افزایش معنادار بیان ژن med 13 در عضلة نعلی رتهایی میشود که چهارده هفته فعالیت استقامتی را پشت سر گذاشتند، در صورتی که تأثیری بر بیان این ژن در عضلة تند انقباض، یعنی عضلة EDL، نداشت. لازم به یادآوری است پژوهشی صورت نگرفته است که تأثیر فعالیتهای استقامتی بر بیان ژن med 13 رادر عضلة اسکلتی ارزیابی کند. این پژوهش در این مورد جزو نخستین پژوهشهاست. بنابراین، نتیجة این پژوهش با توجه به مطالعاتی تفسیر میشود که به شناسایی و بررسی سایر جنبههای این ژن انجامیده است یا پژوهشهایی که ارتباط این ژن را با سایر پروتئینها نشان دادهاند. مشخص شده است که med 13 عملکرد کمپلکس RNA pol II و دستگاه رونویسی عمومی را تسهیل میکند [16] و موجب فعالسازی طیف گستردهای از فعالکنندههای گیرندة تیروئید میشود. همچنین، بر عملکرد گیرندههای هورمون تیروئید تأثیر دارد [17].
پژوهشها نشان دادهاند که فعالیت استقامتی موجب افزایش میزان هورمونهای تیروکسین (t4) و ترییدوتیرونین (t3) و هورمون محرک تیروئید (TSH) میشود [12]. همانطور که فعالیت بدنی بر افزایش بیان هورمونهای تیروئیدی تأثیر دارد، بر گیرندة خود هورمون (موجود در هستة سلول) با عنوان TR[1] نیز تأثیر میگذارد [27]. پژوهشها نشان دادهاند که فعالیتهای ورزشی موجب بهبود کارکرد گیرندههای بتا یک و آلفا یک هورمون تیروئید آزمودنیهای مسن نسبت به افراد جوان اما غیرفعال میشود. همچنین، مشخص شده است که میزان پروتئین آنها را بهطور معناداری نسبت به گروه تمریننکرده افزایش میدهد و فعالیت اتصال به DNA این پروتئین (به ناحیة تنظیمی رونویسی MHC آلفا) را افزایش میدهد و از این طریق موجب افزایش بیان این پروتئین میشود [27] که در نهایت عملکرد قلب حتی بعد از برخی نارساییها را بهبود میبخشد [28]. از آنجا که فاکتور med 13 با گیرندههای هورمون تیروئید در تعامل است و آثار هورمون تیروئید را تسهیل میکند [17] و هورمون تیروئید موجب القای MHC نوع I میشود، احتمالاً افزایش آن در عضلة کند انقباض در این پژوهش ناشی از فعالیتهای استقامتی، نشاندهندة این حقیقت است که فعالیت بدنی با افزایش این فعالکننده آثار هورمون تیروئید بر عضلة کند انقباض را تسهیل میکند و موجب سازگاری ویژه در این عضله میشود که پیامد آن بهبود کارایی این عضله در مواجهه با چالشهای متابولیکی است.
در این پژوهش، مشاهده شد که میزان بیان ژن med 13 در عضلة اسکلتی EDL تحت تأثیر فعالیت استقامتی قرارنمیگیرد. در توجیه این یافته احتمالاً بتوان به تغییرات پسرونویسی اشاره کرد، زیرا برخی پژوهشها نشان دادهاند که علیرغم عدم تغییر در سطح رونویسی، تعدیلات پسرونویسی در پاسخ به فعالیتهای استقامتی تأثیرگذار است [29، 30].
از آنجا که این پژوهش جز نخستین پژوهشها در این مورد بود و علیرغم جستجوی فراوان نتوانستیم در این مورد پژوهش مشابهی را بیابیم، لذا نتوانستیم نتایج این پژوهش را با نتایج پژوهشهای مشابه مقایسه کنیم که یکی از محدودیتهای این پژوهش محسوب میشود. همچنین، در این پژوهش میزان پروتئین MED 13 ارزیابی نشد که در حقیقت واحدهای عملکردی ژن بهحساب میآید. بنابراین، در تعمیم یافتههای این پژوهش باید جانب احتیاط را نگه داشت. در پایان پیشنهاد میشود پژوهشی صورت گیرد که میزان پروتئین MED 13 در پاسخ به فعالیت استقامتی در عضلات تند و کند انقباض را ارزیابی کند.
نتیجهگیری
علیرغم فعالیت استقامتی یکسان در عضلات تند و کند انقباض، میزان بیان ژن med 13 در دو عضله متفاوت بود که احتمالاً ناشی از تفاوت حساسیت این عضلات به سطح هورمون تیروئید است.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه لرستان صورت گرفت. بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه لرستان تشکر و قدردانی بهعمل میآید.