بررسی اثر سایتوتوکسیک سیلیبینین بر رده سلولی MCF-7

سیده المیرا یزدی روح الامینی¹، نسرین معتمد ^2*، محمد طهماسب ³ ، کبری امید فر⁴

¹ دانشجوی کارشناسی ارشد  ژنتیک، گروه سلولی و ملکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران.

² دانشیار گروه سلولی و ملکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران.

³ استادیار گروه سلولی و ملکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران.

⁴ دانشیار، مرکز تحقیقات بیوسنسور، پژوهشکده علوم سلولی و ملکولی غدد و متابولیسم، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

* نشانی نویسنده مسؤول: تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده زیست شناسی، دکتر نسرین معتمد

E-mail: motamed2@khayam.ut.ac.ir

چکیده

زمینه و هدف:سرطان­های متاستاتیک مثل سرطان پستان، عموما نسبت به شیمی­درمانی مقاوم هستند؛ لذا یافتن ترکیبات مؤثر و جدید برای درمان این نوع سرطان­ها مورد توجه محققین قرار دارد. در این مطالعه اثر سمی سیلیبینین بر رشد و تکثیر رده سرطانی MCF-7 بررسی شده است.

مواد و روش­ها: به­منظور بررسی اثر مهاری سیلیبینین بر فعالیت متابولیکی سلول­های MCF-7 تست MTT انجام شد. برای این منظور سلول­ها در پلیت 96 خانه کشت داده شدند و سپس در معرض غلظت­های مختلف سیلیبینین (350-0) میکروگرم بر میلی­لیتر در زمان­های متفاوت 72-48-24 ساعت قرار گرفتند و به این ترتیب درصد فعالیت متابولیکی سلول ها محاسبه شد، همچنین به­منظور بررسی تأثیر سیلیبینین بر آپوپتوز تست کاسپاز 3 و 7 انجام شد.

یافته­ها:نتایج این تحقیق نشان داد سیلیبینین باعث مهار فعالیت متابولیکی رده سلولی MCF-7 به­صورت وابسته به دوز و زمان می­شود، همچنین آپوپتوز را در این سلول­ها القا می­کند.

نتیجه­گیری: این تحقیق نشان داد که تیمار رده سلولی MCF-7 با سیلیبینین می­تواند از طریق القای آپوپتوز، سبب مهار رشد و تکثیر شود. با توجه به تأثیر مهاری معناداری که تیمار سلول­ها با سیلیبینین به­دنبال دارد، به­نظر می­رسد که زمینه تحقیقاتی مناسبی برای بهره­برداری از گیاه خار مریم در کنترل و درمان سرطان­ها وجود دارد.

مقدمه

            سرطان پستان یکی از شایع­ترین بیماری­ها در سراسر جهان و به­عنوان دومین علت مرگ­و­میر ناشی از سرطان در زنان شناخته می­شود (2,1). شیوع این سرطان به حدی است که گفته می­شود در برخی کشورهای غربی از هر 7 نفر خانم یک نفر در طول عمر خود دچار سرطان پستان خواهد شد این مهم به­ویژه در بانوان میانسال نگران کننده­تر است (4,3).

از عوامل اساسی بروز سرطان می­توان به عوامل محیطی از جمله آلودگی هوا، استرس، الگوی زندگی و رژیم غذایی افراد اشاره کرد که با ایجاد جهش و تغییرات ژنتیکی، مسـئول بروز بدخیمی­ها هستند (7-5). از طرفی دیگـر، علیرغم استفاده از راهکارهای درمانی از جمله جراحی، شـیمی­درمانی و رادیوتراپی همچنان میزان مرگ­و­میر در بیماران مبتلا بالا می­باشد که خود حکایت از ناکارآمدی این راهکارهای درمانی دارد. به علاوه، تأثیر مخرب شیمی­درمانی و پرتودرمانی بر سلول­های نرمال در حال تقسیم نیز از جمله معایب دیگر ایـن نوع درمان­ها محسوب می­شود. مشخص شده است که مصرف مواد غذایی که دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی است، در پیشگیری و کاهش ابتلاء به سرطان­ها نقش مؤثری دارد. لذا با توجه به موارد اشاره شده، تمایل به استفاده از فراورده­های گیاهی دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی طی سال­های اخیر بسیار افزایش داشته است. در این میان آنتی­اکسیدان­های پلی­فنول طبیعی، به­علت کارایی بالا و تأثیر جانبی کم به­عنوان یکی از مؤثرترین ترکیبات ضد­سرطان شناسایی شده­اند (9,8).

سیلیمارین یک فلاوونوئیـد پلی­فنولیک است که از دانه­های گیاه خارمریم (milk thistle) استخراج شده و حدود 90 درصد از آن را ترکیبی به نام سیلیبینین (silibinin) به خود اختصاص می­دهد. سیلیبینین ناهماهنگی بین بقای سلول و آپوپتوز را از طریق دخالت در بیان ژن­های دخیل در‌ چرخه‌ی سلولی و آپوپتوز، تنظیم می­کند. بررسی­های مهار رشد و تکثیر سلول­های سرطانی روی سیلیبینین مؤید نقش آن به­عنوان ترکیبی ضد سرطانی می­باشد (12-10). نقش ضد سرطانی این ترکیب روی ریه (13)، تخمدان (14)، گلیوبلاسـتوما (15)، پروستات (16)، مثانه (17)، کبد (18)، پستان (19) و کلون (20) گزارش شده است. ­­­­

مواد و روش­ها

کشت سلول

رده سلولی MCF-7 از بانک سلولی انسیتو­ پاستور (تهران، ایران) تهیه شد. سلول­ها در محیط کشت RPMI1640 (Gibco) همراه با یک درصد آنتی بیوتیک پنیسیلین- استرپتومایسین (Sigma) و ده درصد سرم جنین گاوی (Gibco) کشت داده شدند و در انکوباتور °C 37 و فشار %5 از CO₂ رشد داده شدند.

تیمار سلول­ها و سنجش تکثیرسلولی

ابتدا سلول­های MCF-7 ، با غلظت­های 50 ، 75 ، 100 ، 150 ، 200 ، 250 ، 300 و 350 میکروگرم بر میلی­لیتر از داروی سیلیبینین تیمار شدند، سپس به­ترتیب پس از زمان­های 24 ، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفتند.

جهت اندازه­گیری توان­حیاتی سلول و اثرات سمی سیلیبینین بر رشد و تکثیر رده سلولی MCF-7، از تست MTT استفاده شد. در اجرای این روش، به­ترتیب زیر عمل شده است:  ابتدا میزان 7000 سلول در هر یک از چاهک­های  پلیت 96 خانه کاشته شد و به­مدت 24 ساعت به منظور چسبیدن به کف پلیت و رسیدن به تراکم 70 درصد به آن­ها زمان داده شد، سپس با غلظت­های مذکور از سیلیبینین تیمار و پس از زمان­های 24 ، 48 و 72 ساعت، محیط هر چاهک با 100 میکرولیتر محلول متیل تیازولتترازولیوم (MTT) تعویض و به­مدت 4 ساعت انکوبه شد. سپس بلورهای فورمازان حاصل در 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید حل وجذب آن توسط دستگاه  ELISA-reader )مدل power wave xs2 ساخت شرکت BioTek (، در طول موج 570 نانومتر اندازه­گیری شد (با سه بار تکرار). برای محاسبه اثر توکسیسیتی داروی سلیبینین بر روی بقاء سلول­های MCF-7 و بررسی میزان مرگ سلول­های تیمار شده از فرمول زیر استفاده شد:

100 × = درصد توانایی حیاتی سلول­ها

در این فرمول، OD _exp و OD _cont به­ترتیب بیانگر جذب نوری سلول­های تیمار شده و سلول­­های تیمار نشده (کنترل) می­باشد. پس از اندازه­گیری جذب نوری محلول­ها IC₅₀ سلول­ها در هر بازه ی زمانی محاسبه شد.

سنجش فعالیت کاسپاز3 و7

در این مرحله از کیت کاسپاز 3 و 7 شرکت  Promega استفاده شده است. این کیت میزان لومینسانس ایجاد شده در اثر فعالیت آنزیم­های کاسپاز ۳ و ۷ را اندازه­گیری می­کند. کاسپازها از پروتئازهای سیستئین- آسپارتیک اسید هستند و نقشی اساسی در آپوپتوز سلول­های پستانداران دارند. کیت کاسپاز ۳ و ۷ حاوی پروتئین آمینولوسیفرین متصل شده به تتراپپتید DEVD (آسپارتیک اسید، گلوتامین، والین، آسپارتیک اسید) می­باشد که به­عنوان پیش ماده اختصاصی برای کاسپازهای ۳ و ۷ عمل می­کند. همچنین، این کیت دارای بافری مناسب برای فعالیت کاسپاز و لوسیفراز است. افزودن این بافر به سلول­ها موجب تجزیه آن­ها و سپس جداشدن تتراپپتید از آمینولوسیفرین، در اثر فعالیت کاسپازها می­شود. به­دنبال آن، آمینولوسیفرین به­عنوان پیش ماده لوسیفراز عمل کرده و این آنزیم باعث تجزیه آن شده و لومینسانس تولید می­کند. پرتونوری تولیدشده متناسب با میزان فعالیت کاسپازهای تولیدشده در سلول­های در حال آپوپتوز بوده و توسط دستگاه لومینومتر در دامنه ٤٠٠ تا ٧٠٠ نانومتر آشکارسازی می­شود. برای این منظور سلول­ها را در فلاسک T-25 کاشته و پس از 24 ساعت که تراکم آن­ها به 70 درصد رسید، بر اساس نتایج به­دست آمده از تست MTT ، سلول­ها را با دوزهای 75 ، 100 ، 150 و 200 میکروگرم بر میلی­لیتر از سیلیبینین تیمار کرده و سپس به مدت 48 ساعت درون انکوباتور قرار داده شدند. پس از طی این زمان با اضافه کردن بافرلیز سلولی به هر فلاسک سلول­ها به­صورت سوسپانسیون در یـخ، به­مدت ده دقیقـه انکوبـه و سانتریفوژ (1 دقیقــه و ×g 10000) گردیدند. سپس 5 میکرولیتر از معرف با سوپرناتانت حاصل از سانتریفوژ، ادغام شده و و پلیت در انکوبــاتور 37 درجه سانتیگراد به­مدت دو ساعت انکوبه شد. شکست کروموفور توسط کاسپاز 3 و 7 ، مؤید فعالیت آنزیم می­باشد که با استفاده از دستگاه لومینومتر میزان نشر نور اندازه­گیری شد. برای دقت بیشتر نتایج، هر تیمار سلولی، سه بار کشت داده شده و میزان جذب آن خوانده شده است.

از نرم­افزار Graphpad (prism 6) برای آنالیز داده­های حاصل از MTT و تست کاسپاز 3 و7 در دوزها و زمان­های مختلف استفاده شد و معناداری نتایج مورد بررسی قرار گرفت. مقادیر به­دست آمده با 05/0p< از نظر آماری معنادار بود.

یافته­ها

نتایج تأثیر سیلیبینین بر توان­حیاتی سلول­ها حاکی از آن بود که غلظت­های 50 ، 75 ، 100 ، 150 ، 200 ، 250 ، 300 و 350 میکروگرم بر میلی­لیتر نسبت به گروه کنترل سبب مهار رشد سلول­ها شدند. در غلظت­های پایین سیلیبینین (50 و 75 میکروگرم بر میلی­لیتر) کاهش معناداری در توان زیستی سلول­ها مشاهده نشد. مقایسه داده­ها دردوزهای مورد استفاده برای سیلیبینین برای زمان­های مختلف نشان داد که روند کاهش درصد توان زیستی سلول­ها با افزایش غلظت و با گذشت زمان همراه است (شکل 1).

همچنین برای هر یک از زمان­های 24، 48، 72 ساعت دوزی از سیلیبینین که به­واسطه آن 50 درصد سلول­ها زنده می­مانند محاسبه و تعیین شد (جدول 1).

شکست پروتئولیتیک پروتئین­های سلولی بـا ارزیابی فعالیت کاسپاز مشخص شد، به­طوری­که در بالاترین غلظت سیلیبینین استفاده شده در این مطالعه (200 میکروگرم بر میلی­لیتر) طی مدت زمان 48 ساعت پس از تیمار ، بیشترین فعالیت کاسـپاز 3و 7 مشـخص گردیـد. پـس بـا افـزایش غلظت سیلیبینین افزایش معناداری در فعالیت کاسپاز ایجاد شد که مؤید افزایش فعالیت مولکول­های پرو­آپوپتوزی در برابر محرک های القایی آپوپتـوز (سیلیبینین) می­باشد (شکل 3).

بحث

در این پروژه نشان داده شد که تیمار رده سرطانی MCF-7 با سیلیبینین می­تواند سبب مهار رشد سلول­های MCF-7 شود. در مطالعاتی که در سال 2014 توسط یوسفی و همکاران صورت گرفت نشان داده شد که سیلیبینین سبب مهار تکثیر سلول­های سرطانی SKBR3 می­گردد و با افزایش غلظت به­کار رفته اثر مهار آن نیز افزایش می­یابد (21). در همین سال توسط Reyhan Akhtar و همکاران نشان داده شد که سیلیبینین دارای خواص ضدسرطانی بر روی رده­ی سرطانی کولون HT-29 می باشد. همچنین سیلیبینین به­طور مؤثری سبب مهار رشد سلول­های سرطانی پروستات رده­های 1AsPC- ، 3BxPC- و 1Panc- می­شود که با القاء آپپتوز همراه است (22). هم­راستا با نتایج حاصل از تحقیقات سایرین، نتـایج حاصـل از این پروژه نشان می­دهد که سیلیبینین بر روی رده سرطانی MCF-7 اثر سمی وابسته به دوز و زمان دارد. با توجه به نتایج MTT سیلیبین در غلظت­های بیشتر از 75 میکروگرم بر میلی­لیتر پس از 48 ساعت براین رده سلولی اثر مهارکنندگی بر تکثیر سلولی دارد. همچنین مقایسه نتایج حاصل از تست MTT و تست کاسپاز نشان داد که در غلظت­های بالای سیلیبینین (بیش از 75 میکروگرم بر میلی­لیتر) که میزان فعالیت کاسپاز در آن­ها بالاتر می­باشد، باعث کاهش معناداری در میزان زنده ماندن سلول­ها در نتایج حاصل از تست MTT نیز می­شوند. به­نظر می­رسد القای مرگ برنامه­ریزی شده سلولی از مهم­ترین مکانیسم­های مؤثر در فعالیت ضدسرطانی سیلیبینین می­باشد که یافته­های این بررسی آن را تأیید می­کند .

در مجموع، نتایج حاصل از پژوهش انجام شده مؤید خاصیت پروآپوپتوتیک سیلیبینین و اثربخشی این ترکیب گیاهی علیه رده­ سرطانی MCF-7 می­باشد. با توجه به اینکه نتایج این تحقیق صرفاً روی رده سرطانی MCF-7 انجام شده است، تأثیر این ترکیب روی سلول­های طبیعی نیازمند بررسی بیشتر می­باشد.

References

1. Chavez KJ, Garimella SV, Lipkowitz S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Dis. 2010;32(1-2):35-48.
2. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 2001;94(2):153-6.
3. Mousavi SM, Montazeri A, Mohagheghi MA, Jarrahi AM, Harirchi I, Najafi M, et al. Breast cancer in Iran: an epidemiological review. Breast J. 2007;13(4):383-91.
4. Montazeri A, Vahdaninia M, Harirchi I, Harirchi AM, Sajadian A, Khaleghi F, et al. Breast cancer in Iran: need for greater women awareness of warning signs and effective screening methods. Asia Pac Fam Med. 2008;7(1):6.
5. Mousavi SM, Mohaghegghi MA, Mousavi-Jerrahi A, Nahvijou A, Seddighi Z. Burden of breast cancer in Iran: a study of the Tehran population based cancer registry. Asian Pac J Cancer Prev. 2006;7(4):571-4.
6. Cornelis MC, Agrawal A, Cole JW, Hansel NN, Barnes KC, Beaty TH, et al. The Gene, Environment Association Studies consortium (GENEVA): maximizing the knowledge obtained from GWAS by collaboration across studies of multiple conditions. Genetic Epidemiol. 2010;34(4):364-72.
7. Møller P, Wallin H, Knudsen LE. Oxidative stress associated with exercise, psychological stress and life-style factors. Chem Biol Interact. 1996;102(1):17-36.
8. Jung IL. Soluble extract from Moringa oleifera leaves with a new anticancer activity. PloS One. 2014;9(4):e95492.
9. Lee JY, Hwang WI, Lim ST. Antioxidant and anticancer activities of organic extracts from Platycodon grandiflorum A. De Candolle roots. J Ethnopharmacol. 2004;93(2-3):409-15.
10. Deep G, Agarwal R. Antimetastatic efficacy of silibinin: molecular mechanisms and therapeutic potential against cancer. Cancer and Metastasis Rev. 2010;29(3):447-63.
11. Kim S, Lee HS, Lee SK, Kim SH, Hur SM, Kim JS, et al. 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)-induced growth arrest is increased by silibinin by the down-regulation of cyclin B1 and cdc2 and the up-regulation of p21 expression in MDA-MB231 human breast cancer cells. Phytomedicine. 2010;17:1127–32.
12. Tyagi A, Singh RP, Agarwal C, Agarwal R. Silibinin activates p53-caspase 2 pathway and causes caspase-mediated cleavage of Cip1/p21 in apoptosis induction in bladder transitional-cell papilloma RT4 cells: evidence for a regulatory loop between p53 and caspase 2. Carcinogenesis. 2006;27(11):2269-80.
13. Chu SC, Chiou HL, Chen PN, Yang SF, Hsieh YS. Silibinin inhibits the invasion of human lung cancer cells via decreased productions of urokinase‐plasminogen activator and matrix metalloproteinase‐2. Mol Carcinog. 2004;40(3):143-9.
14. Zhou L, Liu P, Chen B, Wang Y, Wang X, Internati MC, et al. Silibinin restores paclitaxel sensitivity to paclitaxel-resistant human ovarian carcinoma cells. Anticancer Res. 2008;28(2A):1119-27.
15. Momeny M, Malehmir M, Zakidizaji M, Ghasemi R, Ghadimi H, Shokrgozar MA, et al. Silibinin inhibits invasive properties of human glioblastoma U87MG cells through suppression of cathepsin B and nuclear factor kappa B-mediated induction of matrix metalloproteinase 9. Anticancer Drugs. 2010;21(3):252-60.
16. Zi X, Agarwal R. Silibinin decreases prostate-specific antigen with cell growth inhibition via G1 arrest, leading to differentiation of prostate carcinoma cells: implications for prostate cancer intervention. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(13):7490-5.
17. Tyagi A, Agarwal C, Harrison G, Glode LM, Agarwal R. Silibinin causes cell cycle arrest and apoptosis in human bladder transitional cell carcinoma cells by regulating CDKI–CDK–cyclin cascade, and caspase 3 and PARP cleavages. Carcinogenesis. 2004;25(9):1711-20.
18. Momeny M, Khorramizadeh MR, Ghaffari SH, Yousefi M, Yekaninejad MS, Esmaeili R, et al. Effects of silibinin on cell growth and invasive properties of a human hepatocellular carcinoma cell line, HepG-2, through inhibition of extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation. Eur J Pharmacol. 2008;591(1-3):13-20.
19. Kim S, Choi JH, Lim HI, Lee S-K, Kim WW, Kim JS, et al. Silibinin prevents TPA-induced MMP-9 expression and VEGF secretion by inactivation of the Raf/MEK/ERK pathway in MCF-7 human breast cancer cells. Phytomedicine. 2009;16(6-7):573-80.
20. Hogan FS, Krishnegowda NK, Mikhailova M, Kahlenberg MS. Flavonoid, silibinin, inhibits proliferation and promotes cell-cycle arrest of human colon cancer. J Surg Res. 2007;143(1): 58-65.
21. Tyagi AK, Agarwal C, Chan DC, Agarwal R. Synergistic anti-cancer effects of silibinin with conventional cytotoxic agents doxorubicin, cisplatin and carboplatin against human breast carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 cells. Oncol Rep. 2004; 11(2):493-9.
22. Ge Y, Zhang Y, Chen Y, Li Q, Chen J, Dong Y, et al. Silibinin causes apoptosis and cell cycle arrest in some human pancreatic cancer cells. Int J Mol Sci. 2011;12(8):4861-71.

A Survey on Silibinin Cytotoxic Effect on MCF-7 cell line

Sayedeh Elmira Yazdi-Rouholamini

Master Student in Genetic, Department of Cell and Molecular Biology, School of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran

*Nasrin Motamed

Associate Professor, Department of Cell and Molecular Biology, School of Biology University of Tehran, Tehran, Iran

Mohammad Tahmaseb

Assistant professor, Genetic, Department of Cell and Molecular Biology, School of Biological Sciences Kharazmi University, Tehran, Iran

Kobra Omidfar

Associate Professor, Biosensor Research Center, Endocrinology and Metabolism Molecular -Cellular Sciences Institute, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran