بررسیاثرسمیتسلولیعصارهیمتانولی میوه گیاه هنده­بید بر

 سلول­هایسرطانپستان

لیلا سادات الداغی¹، حسن رضائی سرشت²، حمید چشمی^3*

¹ کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی، مرکز تحقیقات سلولی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، سبزوار، ایران

² کارشناسی ارشد فیتوشیمی، گروه بیوشیمی تغذیه، مرکز تحقیقات طب سنتی و جامع نگر، دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، سبزوار، ایران

³ کارشناسی ارشد علوم سلولی مولکولی، گروه بیوشیمی تغذیه، مرکز تحقیقات سلولی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، سبزوار، ایران

*نشانی نویسنده مسؤول: سبزوار، دانشگاه علوم پزشکی، گروه بیوشیمی تغذیه، مرکز تحقیقات سلولی مولکولی، حمید چشمی

E-mail: hamid.ch65@gmail.com

وصول:18/9/94، اصلاح:21/11/94، پذیرش:27/1/95

مقدمه

                سرطان بیماری است که در نتیجه تکثیر و رشد بدون کنترل سلول­ها ایجاد می­شود. سلول­های سرطانی، توده توموری را ایجاد مـی­کنند کـه در برخی موارد قابلیت گسـترش و تهـاجم به سایـر نقـاط بـدن را بـه­دست می­آورد(1).

درمان سرطان با روش­های متنوعی همچون جراحی، پرتو درمانی، شیمی­درمانی، ژن­درمانی و ... صورت می­گیرد که در این بین از شیمی­درمانی به­عنوان یکی از پدیده­های قرن بیستم نام برده می­شود (2). در این روش درمانی از داروهایی استفاده می­شود که باعث مهار یا کاهش سرعت رشد سلول­های سرطانی که به­سرعت در حال تقسیم هستند، می­گردند. داروهای مذکور، علاوه بر سلول­های سرطانی سبب تخریب سلول­های سالم نیز می­شود. بنابراین امروزه تحقیقات زیادی جهت بهینه­سازی شیمی درمانی و استفاده از داروهایی با کمترین اثرات جانبی در حال انجام است. در شیمی درمانی، مقاومت در برابر دارو از اصلی­ترین مشکلات درمان محسوب می­شود. بنابراین نیاز به داروها و روش­های درمانی جدید همواره یکی از چالش­های این روش درمانی بوده و این امر پژوهشگران را به سمت یکی از بهترین منابع به­دست آوردن داروهای بهینه جهت استفاده در این روش درمانی یعنی گیاهان، به­خصوص گیاهان بومی هر کشور که منبع بسیار مناسبی جهت به­دست آوردن داروهای طبیعی و شیمیایی جهت درمان انواع مختلف بیماری­ها از جمله سرطان می­باشند، سوق داده است. البته بر اساس تأکید سازمان بهداشت جهانی، استفاده از طب سنتی ممکن است دارای عوارض منفی و نامطلوب نیز باشد و لازم است در مورد استفاده از هر گیاه و یا ماده­ای که در طب سنتی استفاده می­شود تحقیقات جامعی صورت پذیرد (3).

مقاومت سلول­های سرطانی نسبت به داروهای سیتوتوکسیکی که به­طور رایج در شیمی­درمانی تجویز می­شوند و از نظر ساختاری و عملکردی با یکدیگر متفاوت هستند مقاوت چند داروئی نامیده می­شود (4). مقاومت چند دارویی سلول­های سرطانی اصلی­ترین عامل ناکارامدی شیمی­درمانی محسوب می­شود؛ به­همین دلیل پس از شناسایی پروتئین­های دخیل در مقاومت دارویی، شناخت و بررسی ترکیبات مهارکننده پروتئین­های مذکور یکی از مهم­ترین اهداف محققین محسوب می­شود. در این رابطه تلاش­های به­عمل آمده منتهی به شناسایی سه نسل از داروهای مهارکننده مقاومت چند دارویی شده است (5).

یکی از گیاهانی که در طب سنتی ایران استفاده می­شود گیاه هنده­بید است. این گیاه متعلق به جنس vitex از خانواده Verbenaceae می­باشد. خانواده مذکور دارای بیش از 250 گونه بوده که گیاه مدنظر این مطالعه در مناطق کوهپایه ای رشد نموده و ارتفاع آن تا 3 متر می رسد. این گیاه با نام های پنج انگشت، بنگله نیگرو گنگ، گناک و هنده بید و با نام علمی vitexpseudonegundo شناسایی گردیده و بصورت درختچه هایی با پایه های چوبی مشاهده می شود (6). گونه مذکور، دامنه رویشگاهی بالایی داشته و در آسیای غربی، سوریه، کردستان، ایران و افغانستان گسترش دارد. از هنده بید در طب سنتی به منظور درمان بسیاری از مشکلات و بیماری های مربوط به زنان همچون آمنوره، دیسمنوره، نارسایی جسم زرد، هیپرپرولاکتینوما، نازایی، آکنه، یائسگی و اختلالات شیر دهی استفاده می گردد. (7) گزارشات و مطالعات انجام گرفته نشان داده است که برخی گونه های جنس vitex به منظور تسکین درد های روماتیسمی و رگ به رگ شدگی کاربرد داشته و برخی نیز دارای خواص ضدسرطانی، مدر و بهبود دهنده عفونت های تنفسی می باشند. بررسی های فیتوشیمیایی نشان داده اند که اعضای این جنس دارای ترکیباتی شامل فلاونوئیدها، ترپنوئیدها، اکدی استروئیدها و گلیکوزیدهای ایریدوئید می باشند(8). از این رو و با توجه به فقدان هرگونه مطالعه بر روی این گونه گیاهی در زمینه سمیت احتمالی عصاره متانولی آن در مقابل سلول های سرطانی، در این مطالعه برای اولین بار به بررسی میزان سمیت سلولی عصاره گیاه مذکور، به عنوان یکی از گیاهان بومی ایران، در مقابل رده سلولی MCF7 پرداخته شده است.

مواد و روش ها

جمع آوری گیاه و عصاره گیری

گیاه هنده­بیددر مرداد ماه سال 1392 از کوه پایه های روستای طبس واقع در شهرستان سبزوار جمع­آوری گردید.  برای انجام این تحقیق میوه­های خشک این گیاه آسیاب گردید و سپس عصاره­گیری متانولی به روش خیساندن انجام پذیرفت. بدین منظور 10 گرم از میوه گیاه مورد نظر، پودر شده و سپس به­مدت 6 روز در مجاورت ml50×2 از حلال متانول در دمای اتاق قرار گرفت. در گام بعد به عصاره حاصل اجازه داده شد تا در شرایط دمای اتاق و تاریکی با مکانیسم حلال پرانی تغلیظ و خشک گردد. در نهایت، عصاره خشک بدست آمده توزین گردید (67/0 گرم) و تا زمان آغاز آزمایشات مربوط به کشت سلولی به دور از گرما و نور، در  ظرف شیشه ای در بسته و درون یخچال، نگه­داری شد.

تهیه رقت­های مختلف از عصاره گیاه

عصاره گیاهی حاصل از مرحله قبل، به­وسیله ترازوی حساس دیجیتالی توزین گردید. سپس عصاره خشک توزین شده در 100 میکرو لیتر DMSO به­صورت محلول درآورده شد. در گام بعدی، رقت‌های مختلف موردنیاز با افزودن محیط کشت سلولی(RPMI 1640)  تهیه شد. رقت‌های مورداستفاده در این تحقیق شامل 5، 10، 20، 30، 40، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. به‌منظور کاهش حداکثری اثر سمیت DMSO بر روی سلول‌های موجود در چاهک‌ها، غلظت این ماده در هر چاهک کمتر از 1% منظور گردید.

بررسی سمیت سلولی مواد با استفاده از آزمون MTT

سمیت سلولی عصاره متانولی میوه گیاه هنده بید بر روی رده سلولی سرطان پستان (MCF7) به روش آزمون رنگ سنجی MTT(3-(4و5- دی متیل تیازول 2- ایل)- 2،5- دی فنیل تترازولیوم برماید) تعیین گردید. به این صورت که رده سلولی مورد بررسی، در محیط کشت RPMI 1640 که حاوی پنی­سیلین ( IU/ML100)، استرپتومایسین (IU/MI100)، گلوتامین (mmol2) و FBS 10 درصد بود در دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار 5 درصد دی­اکسیدکربن در فلاسک­های با مساحت ²cm 75 کشت گردید. در مرحله بعد و با گذشت حدود سه روز و پوشیده شدن بستر فلاسک از سلول، لایه سلولی چسبیده به کف فلاسک به روش آنزیمی و با استفاده از تریپسین جدا شد و پس از انتقال به لوله­های آزمایش استریل، به­مدت 8 دقیقه و با شتاب g120 سانتریفیوژ گردید. سپس سلول­ها با محیط کست تازه به حالت معلق درآمده و به چاهک­های پلیت 96 خانه انتقال داده شدند. یک ردیف از چاهک­ها فاقد سلول و فقط حاوی محیط کشت (به­عنوان blank) و یک ردیف نیز حاوی محیط کشت دارای سلول (به­عنوان شاهد یا گروه کنترل) بوده و سایرین با غلظت­های مختلف عصاره موردنظر تیمار گردیدند. پلیت­های مذکور به­مدت 48 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند و سپس محیط درون چاهک­ها تخلیه و به هر چاهک 50 میکرولیتر از محلول MTT افزوده شد. پس از گذشت 4 ساعت، محلول باقیمانده خارج و به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO اضافه شد تا فورمازان حاصله حل گردد. در نهایت پلیت­ها به­مدت 10 دقیقه در تکان دهنده قرار گرفتند و سپس جذب نوری فورمازان در 570 نانومتر با استفاده از خوانشگر پلیت ثبت گردید. درصد حیات سلولی با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:

در فرمول فوق، ODبلانک، چگالی نوری چاهک­های بدون سلول وتنها حاوی DMSO است. OD کنترل، نیز چگالی نوری چاهک­های حاوی سلول و MTT و فاقد ترکیبات مورد آزمایش است.

یافته­ها

به­طور کلی با تأثیر غلظت­های مختلف عصاره میوه گیاه هنده­بید (5، 10، 20، 30، 40، 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر) بر رده سلول­های سرطان پستان (MCF7) مهارکنندگی رشد سلول­ها قابل ملاحظه بود بدین­صورت که پایین­ترین درصد زنده ماندن سلول­ها در غلظت­های 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر به­ترتیب 7/5 و 4/5 درصد به­دست آمد.

میانگین جذب نوری در غلظت­های 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر با میانگین جذب نوری با گروه کنترل متفاوت می­باشد. به­صورتی که میانگین جذب نوری در غلظت­های مذکور به­ترتیب برابر 062/0، 056/0 است، امری که نشان­دهنده مرگ سلولی بالا و اثر سمیت سلولی غلظت­های عصاره موردنظر نسبت به گروه کنترل است. ارتباط زنده ماندن سلول­ها و غلظت­های مورد استفاده در سلول­های سرطانی در نمودار 1 قابل مشاهده است. همان­طور که در نمودار مذکور مشخص است روند زنده ماندن سلول­ها با افزایش غلظت عصاره موردنظر کاهش می­یابد. همچنین IC50 محاسبه شده برای این عصاره میزان 27 میکروگرم بر میلی­لیتر به­دست آمد.

همچنین از بررسی ریخت شناختی سلول­ها پس از تیمار با عصاره موردنظر مشخص گردید که کاهش تعداد سلول­ها کاهش یافته و ظاهری گرانوله پیدا کرده­اند امری که بر مهار رشد سلولی و مرگ سلول­ها صحه می­گذارد.

بحث

یافته­های این مطالعه نشان می­دهد که عصاره متانولی میوه گیاه vitex pseudo-negundo بر رویرده سلولی سرطانی MCF7 در اکثر غلظت­ها دارایسمیت سلولی بوده و بالاترین مهار آن در غلظت­های 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر می­باشد. مهارکنندگی رشد سلول­های MCF7 در سایر مطالعات نیز مورد بررسی قرار گرفته اما در مورد عصاره میوه گیاه هنده­بید، داده­های این مطالعه اولین گزارش را ارائه می­نمایند.

از طرف دیگر، براساس تحقیقی که بر روی اسانس برگ گیاه vitex pseudo-negundo، جمع­آوری شده از حوالی شهر سبزوار انجام گرفت ترکیبات اسانس این گیاه شناسایی گردید که ترکیبات عمده آن 1،8-سینئول (%23/18)، آلفا-پینن (20/16 درصد) و سابینن (67/5 درصد) بود (10). علاوه بر این، در مطالعه دیگری که بر روی قسمت‌های مختلف گیاه مذکور انجام گرفت مشخص گردید که ترکیبات عمده اسانس برگ آن شامل آلفا-پینن (9/35 درصد)، بی سیکلو جرماکرن (5/9 درصد) و لیمونن (2/12 درصد) می­باشند(Sahaf, 2008 #31) در حالی­که اسانس میوه شامل آلفا-پینن (7/31 درصد)، بی سیکلو جرماکرن (5/14 درصد) و لیمونن (5/11 درصد) و اسانس گل شامل آلفا-پینن (7/14 درصد)، بی سیکلو جرماکرن (3/8 درصد) و لیمونن (8/5 درصد) می­باشد (9). همچنین از برگ­ها و ساقه­های این گیاه ترکیب agnuside و aucubin جداسازی گشته است (9).

از طرف دیگر، خاصیت ضدبروسلایی این گیاه در مطالعه­ای دیگر مورد بررسی قرار گرفته و نشان داده شده است که vitexpseudo-negundo دارای اثر ضدباکتریایی می­باشد (12). در مطالعه دیگری که بر روی گیاه VitextrifoliaL. انجام گرفت، 5 ترکیب دی ترپنی از نوع ساختار لابیدانی با نام­های

vitexilactone، (rel5S,6R,8R,9R,10S)-6-acetoxy-9-hydroxy-13(14)-labden-16,15-olide، rotundifuran، vitetrifolin D و vitetrifolin Eجداسازی گردید و مشخص شد که ترکیبات مذکور دارای اثر بازدارندگی چرخه سلولی بوده و آپوپتوز را القا می­نمایند. همچنین مشخص گردید که این 5 ترکیب به طرز چشمگیری منجر به القای آپوپتوز در رده­های سلولی tsFT210و K562در غلظت های بالا شده در حالی­که در غلظت­های کم باعث مهار فرایند چرخه سلولی در فاز  G0/G1 می­شوند (13). همچنین در بررسی دیگری که روی همین گیاه انجام گرفت، شش فلاونوئید persicogenin، artemetin، luteolin، penduletin، vitexicarpin و chrysosplenol-D به­عنوان مهارکننده­های جدید چرخه ی سلولی جداسازی گردیدند (13). در پژوهش دیگری که بر روی برگ­های گیاه Vitex negundo انجام گرفت، ترکیب فلاونوئیدی به­نام vitexicarpin ازعصاره کلروفرمی برگ­های گیاه با استفاده از Bioassay-guided جداسازی گردید و مشخص شد که ترکیب مذکور در مقابل سلول­های سرطانی انسانی دارای اثر سمیت سلولی شدیدی می­باشد (14). همچنین مشخص گردیده که دی­ترپن جداسازی شده از میوه گیاه V. rotundifolia به نام ferruginolدارای خاصیت آنتی­اکسیدانی قوی می­باشد (15). همچنین ترکیب دیگری که از این گیاه استخراج گردیده فلاونوئیدی به­نام Casticinمی­باشد که به­طور قابل ملاحظه­ای دارای خاصیت بازدارندگی رشد سلول­های سرطانی PC-12و HCT116می باشد (16).

در مطالعه ای دیگر، عصاره ی آبی-متانولی (AME) گیاه Vitex trifoliaتوسط حلال های کلروفرم و اتیل استات استخراج گردید و سمیت سلولی عصاره کلروفرمی (CE) و عصاره ی اتیل استاتی (EE) و محلول باقی مانده (RME) پس از استخراج ارزیابی گشته و میزان سمیت سلولی روی رده سلولی Hep-G2 مورد مطالعه قرار گرفت و نتایج مشابهی حاصل آمد (17).

با توجه به عدم پاسخ مطلوب اکثر انواع سرطان ها به روش های مختلف درمانی و پیشرفت سریع آن ها، تحقیق در زمینه تولید داروهایی با کارایی بیشتر و سمیت کمتر ادامه دارد. ترکیبات گیاهی بسیاری با اثرات بیولوژیکی متنوع وجود دارند که بخشی از داروهای ضد سرطانی را در علم داروسازی نوین شامل می­شوند امری که مطالعه بر روی گیاهان بومی مناطق مختلف هر کشور را به منظور توسعه طب سنتی و تولید فراورده های دارویی گیاهی اجتناب­ناپذیر می­سازد. لذا با توجه به مطالعات گذشته در مورد این گیاه که در بالا به برخی از آن ها اشاره گردید و با نظر بر یافته­های این مطالعهدریافتیمکهعصاره­یمتانولیتهیهشده ازمیوه گیاه هنده بید، دارای اثرکشندگیبرسلول­هایسرطانی پستان بوده وتغییراتمورفولوژیمشاهدهشدهدرسلول­هایسرطانیتیمارشدهبااین عصاره،احتمالاًبیانگر القایمرگبرنامه­ریزیشده­یسلول (آپوپتوز) می­باشدکه نیازبهبررسی دقیق­تر و بیشتری دارد. از این رو و با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه می­توان از طریق بررسی تأثیرات این گیاه بر مدل­های حیوانی سرطان و در نهایت انجام تست­های بالینی به نتایج مستدلی جهت استفاده از این گیاه یا فراورده­های آن به­منظور پیشگیری یا بهبود احتمالی سرطان پستان نائل آمد.

References

1. Anand P, Kunnumakkara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Tharakan ShT, Lai OS, et al. Cancer is a preventable disease that requires major lifestyle changes. Pharm Res. 2008; 25(9): 2097–16.
2. Iradyan MA, Iradyan NS, Arsenyan FG, Stepanyan GM. Imidazole derivatives and their antitumor activity. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2009; 43: 439-43.
3. Meijerman I, Beijnen JH, Schellens JH. Combined action and regulation of phase II enzymes and multidrug resistance proteins in multidrug resistance in cancer. Cancer Treat Rev. 2008; 34(6): 505–20.
4. Gottesman MM. How cancer cells evade chemotherapy. Cancer Research. 1993; 53:747-54.
5. Ambudkar SV, Kimchi-sarfaty C, Sauna ZE, Gottesman MM. P-glycoprotein: From geumics to mechanism. Oncogene. 2003; 22(47):7468-85.
6. Boroomandfar   KH,   Kazemiyan   A, Safdari FM. Effect of Vitex on hot flash of menopausal women referred to health center of Isfahan.  J  Birjand  Univ Med Sci.    2007;    14(3): 9-15. [Persian]
7. Tandon    VR,    Guota    RK.    An experimental evaluation of anticonvulsant activity of vitex-negundo. Indian J Physiol Pharmacol. 2005; 49(2) : 199–205.
8. Kirtikar  JD,  Basu  BD. Indian  Medicinal Plants    Vol-III,  2nd  ed;  (1981)  NISCOM:  New Delhi.
9. HadjMohammadi MR, Afif AA, Rezaee MB. Chemical Composition of Leaf, Flower and Fruit Oil of Vitex pseudo-negundo (Hausskn.) Hand.-Mzt. Fro Iran. Journal of Essential Oil Research. 2006;18(3):308-9.
10. Sahaf BZ, Moharramipour S, Meshkatalsadat MH. Fumigant toxicity of essential oil from Vitex pseudo-negundo against Tribolium castaneum (Herbst) and Sitophilus oryzae (L). Journal of Asia-Pacific Entomology. 2008;11(4):175-9.
11. Rimpler H. Iridoids and ecdysones from Vitex species. Phytochemistry. 1972;11(8):2653-4.
12. Motamedi H, Darabpour E, Gholipour M, Seyyed Nejad SM. In vitro assay for the anti-brucella activity of medicinal plants against tetracycline-resistant Brucella melitensis. J Zhejiang Univ Sci B. 2010;11(7):506-11.
13. Li W-X, Cui C-B, Cai B, Yao X-S. Labdane-type diterpenes as new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers from Vitex trifolia L. J Asian Nat Prod Res. 2005;7(2):95–105.
14. Díaz F, Chávez D, Lee D, Mi Q, Chai HB, Tan GT, et al. Cytotoxic flavone analogues of vitexicarpin, a constituent of the leaves of Vitex negundo. J Nat Prod. 2003;66(6):865–7.
15. Hoang VL. Chemical composition of Vitex trifolia L. Tap Chi Duoc Hoc. 2003:113–4.
16. Ono M, Yanaka T, Yamamoto M, Ito Y, Nohara T. New diterpenes and norditerpenes from the fruits of Vitex rotundifolia. J Nat Prod. 2002;65(4):537–41.
17. El-Sayed MM, El-Hashash MM, Mohamed MA, Korany TM. Cytotoxic activity of Vitex trifolia purpurea extracts. J Egypt Soc Parasitol. 2011;41(2):409–16.

Leila Sadat Aldaghi

M.Sc. of Developmental Cell Biology, Cellular and Molecular Research Center, Sabzevar University of Medical Sciences, Sabzevar, Iran.

Hasan Rezaei Seresht

M.Sc. of Phytochemistry, Biochemistry and Nutrition Department, Traditional and Complementary Medicine Research Center, Sabzevar University of Medical Sciences, Sabzevar, Iran.

*Hamid Cheshomi

M.Sc. of Cellular and Molecular Sciences, Biochemistry and Nutrition Department, Cellular and Molecular Research Center, Sabzevar University of Medical Sciences, Sabzevar, Iran.