اثر تحریک الکتریکی کم فرکانس بر جریان­های گاباارژیک نورون­های ناحیه­ی CA1 در برش­های زنده هیپوکمپ موش صحرایی کیندل­شده

اعظم عسگری¹، سعید سمنانیان² ، نفیسه عطاپور³ ، امیر شجاعی⁴ ، وحید شیبانی⁵ ، سید جواد میرنجفی زاده^3و6*

¹ دانشجوی دکترای گروه فیزیولوزی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

² استاد گروه فیزیولوزی، دانشکده علوم  پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

³ استاد مرکز تحقیقات علوم اعصاب، پژوهشکده نوروفارماکولوژی،دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران

⁴ دانشجوی دکترای گروه فیزیولوزی، دانشکده علوم­ پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران ، ایران

⁵ استاد مرکز تحقیقات علوم اعصاب، پژوهشکده نوروفارماکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی کرمان، کرمان، ایران

⁶ استاد گروه فیزیولوزی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

*نشانی نویسنده مسؤول: تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم پزشکی، گروه فیزیولوزی، سیدجواد میرنجفی­زاده

E-mail: mirnajaf@modares.ac.ir

وصول:12/10/94، اصلاح:22/11/94، پذیرش:25/1/95

مقدمه

صرع، مجموعه­ای از اختلالات نورولوژیکی مزمن می­باشد که بعد از سکته­های مغزی و آلزایمر، رایج­ترین اختلال عصبی در انسان است. تظاهرات عصبی حملات صرع متنوع­بوده و از یک حواس­پرتی کوتاه­مدت تا ازدست­رفتن هوشیاری به­مدت طولانی همراه با فعالیت حرکتی غیرطبیعی بروزمی­نماید. امروزه، اساس کنترل صرع  دارودرمانی می­باشد که داروهای متعددی در این زمینه مورد استفاده­قرارمی­گیرند که فنی­توئین، کاربامازپین، فنوباربیتال و والپروئیک اسید ازجمله این داروها هستند. اکثر داروهای ضدّ صرع مورد استفاده، عوارض جانبی در بیماران مصرف­کننده ایجادمی­نمایند (1).

هنوز روش قطعی برای درمان صرع شناخته­نشده­است. داروهای ضدّ صرع موجود تنها درچند درصد موارد باعث ازبین­رفتن تشنّج­می­شوند و دربقیه موارد، تنها تعداد دفعات وقوع تشنج­ها را کاهش­می­دهند. در بسیاری از موارد مصرف توأم داروهای ضد صرع می­تواند اثر بخشی آنها را به شکل قابل ملاحظه­ای افزایش­دهد. علاوه برافزایش اثر بخشی، مصرف توأم داروهای ضدّ صرع می­تواند از بروز مقاومت به یک دارو جلوگیری یا عوارض جانبی آن را بکاهد و به­همین دلیل امروزه در مواردی که مقاومت نسبت به یک داروی ضدّ صرع مشاهده شود، به­ناچار از درمان توام با دو دارو کمک گرفته­می­شود (2, 3).

با وجود استفاده از داروهای ضد صرعی، تقریبا" 30 درصد بیماران از صرع مقاوم به درمان رنج­می­برند (4). در این  بیماران، بافت صرعی به­وسیله­ی جراحی برداشته­می­شود، ولی به­علت عوارض جانبی زیاد آن، محققان به­دنبال یافتن درمان جایگزین دیگر هستند (4, 5). بنابراین، توجه زیادی به استفاده از روش­های درمانی ازجمله تحریک الکتریکی مستقیم ناحیه­ی صرعی معطوف شده­است.

یکی از این روش­های درمانی بالقوه برای صرع مقاوم به دارو، تحریک الکتریکی کم فرکانس (Low-frequency stimulation; LFS) می­باشد. استفاده از تحریک الکتریکی مستقیم مغز، برای تعدیل فعالیت مغزی ازسال 1870 مورد استفاده قرارگرفته­است. امروزه تحریک الکتریکی عمقی مغز برای رفع اختلالات مغزی مقاوم به درمان ازقبیل درد مزمن، بیماری پارکینسون و دیس تونیا مورد استفاده­قرارمی­گیرد (6, 7)، در استفاده از این روش، دو نکته­ی مهم باید درنظرگرفته­شود: نخست این­که کدام ساختارهای مغزی باید تحریک شوند و دُدیگراین­که مشخصات محرّک (ازقبیل فرکانس و شدت و غیره) باید چگونه باشد؟ (8). امروزه سعی می­کنند که در درمان صرع مقاوم به دارو از LFS، که آسیب بافتی کمتری نسبت به تحریکات الکتریکی با فرکانس بالا ایجاد می کند، استفاده­کنند. علاوه براین، مطالعات زیادی نشان­داده اعمال LFS درطی روند یا پس از ایجاد کیندلینگ دارای اثرات مهاری بر تخلیه­های متعاقب و رفتار تشنجی در موش­های صحرایی می­باشد (8-14). هرچند نحوه­ی دقیق ایجاد اثر ضدّ تشنجی LFS مشخص نشده­، اما کاهش تحریک پذیری نورون­ها، افزایش آستانه­ی تشنج، افزایش فعالیت سیناپس­های مهاری و کاهش فعالیت سیناپس­های تحریکی به­عنوان مکانیسم­های احتمالی عملکرد آن پیشنهادشده­است. همچنین احتمال داده­ می­شود که مکانیسم ضدّ تشنجی LFS مشابه با مکانیسم­های دخیل در LTD و یا تضعیف پس از تقویت (Depotentiation) باشد (8).

نتایج حاصل از آزمایش­های Lopez و همکارانش نشان­داد که اعمال LFS باعث افزایش میزان اتصال بنزودیاپین به گیرنده­ی گابا می­شود. بنابراین، آنها این احتمال را مطرح­کردند که اثر ضد تشنجی LFS همراه با افزایش فعالیت سیستم گاباارژیک در مغز می­باشد (6). اما هنوز هیچ گزارش مستقیمی در رابطه­ی تأثیر اعمال LFS بر جریان­های گاباارژیک وجودندارد. بنابراین، در  مطالعه­ی حاضر اثر اعمال الگوهای مختلف LFS بر جریان­های گابااژیک در نورون­های هرمی ناحیه­ی CA1 در برش­های زنده هیپوکمپ در موش­های صحرایی که با استفاده از مدل آزمایشگاهی کیندلینگ دچار تشنج شده­بودند، بررسی­شد.

موادّ و روش­ها

 جراحی  و کارگذاری الکترود

در این مطالعه­ی تجربی از موش­های صحرایی نر بالغ جوان از نژاد ویستار در محدوده­ی وزنی80-60 گرم که تحت شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و در دمای 2± 23 درجه سانتی­گراد نگهداری می­شدند، استفاده­شد. حیوانات به صورت آزاد به آب و غذا دسترسی داشتند وکلیه­ی مراحل کار این مطالعه به تائید کمیته اخلاق دانشگاه تربیت مدرس رسیده­است.

حیوان توسط تزریق داخل صفاقی کتامین (mg/kg100) و زایلازین (mg/kg10) بیهوش­شد و در دستگاه استریوتاکسی قرارگرفت. پس از ایجاد برش و کنار زدن پوست سر، ناحیه­ی ‏برگما شناسایی­شده و براساس مختصات ذکرشده در اطلس پاکسینوس و واتسون(15) ناحیه­ی مربوط به آمیگدال ( mm5/2 به سمت عقب و mm 8/4 به سمت راست نسبت به برگما و mm 5/7 زیر جمجمه) مشخص­­شد)شکل -1). با استفاده از مته­های دندان­پزشکی در محل مشخص­شده، منفذی ایجاد و الکترود سه قطبی درون مغز کار گذاشته­شد. سپس الکترود تک­قطبی با استفاده از پیچ لحیم­شده به آن، بر روی جمجمه متصل­گردید. دو پیچ کوچک دیگری نیز برای استحکام روی نقاط دیگری از جمجمه وصل­شد و الکترودها  و پیچ­ها بوسیله­ی سیمان ‏دندان­پزشکی روی سطح جمجمه ثابت­ شدند. آنگاه پین­های متصل به الکترودهای سه­قطبی و تک­قطبی درون بخش مادگی یک سوکت قرارداده و سوکت با استفاده از سیمان دندان­پزشکی بر روی جمجمه نصب­شد. برای بهبودی زخم­ها و بازگشت به شرایط طبیعی، 7 روز به حیوان استراحت داده ­شد.

برای تحریک حیوان از روش کیندلینگ سریع استفاده­گردید. در این روش حیوانات با موج مربعی تک فازی با مدت پالس 1 میلی ثانیه، فرکانس 50 هرتز، شدت آستانه­ی تولید امواج تخلیه متعاقب و به مدت 3 ثانیه تحریک­شد. مراحل رفتاری تشنج بر اساس معیارهای Racine تقسیم­بندی­شدند: 1) حرکات دهان و انقباض عضلات صورت.

2) حرکت­دادن سر به طرف بالا و پایین 3) کلونوس یکی از اندام­های جلویی طرف مقابل نسبت به محل تحریک 4) کلونوس اندام­های جلویی و ایستادن روی هر دو پا 5) ایستادن روی هر دو پا همراه با از دست­دادن تعادل و افتادن حیوان (16). این تحریکات به فاصله­ی هر 5 دقیقه یک بار و 12 بار در روز انجام­شده و تا زمان نشان­دادن 3 بار مرحله­ی 5 تشنج تحریک­ها اعمال­گردید تا حیوان کاملاً کیندل شود. 24 ساعت بعد از این­که حیوان کاملا کیندل­شد، موش­های صحرایی گروه کنترل و گروه­هایی که تحریکات کیندلینگ را دریافت­کرده­بودند با استفاده از اتر بیهوش و سر آنها جداشد. مغز به­سرعت برداشته و در  ACSF ‏سرد و کربوژنه (‏‎O2‎‏ 95% و ‏‎ CO2‎‏5%) قرارگرفت. برش­های عرضی با ضخامت  µm450 با استفاده از ویبروتوم (Vibratome 1000 plus) تهیه­گردید.‏ محلولACSF  مخصوص  برش­گیری که دارای غلظت کلسیم پایین است حاوی (برحسب mM): سوکروز 238، NaH2PO4 1، NaHCO3 2/26، MgSO4 2، CaCl2 5/0، KCl 5/2 و گلوکز 11 بود. pH در محدوده­ی 4/7-3/7 و اسمولاریته نیز در محدوده­ی mOsm 300-290 تنظیم­شد.  برش­ها در محلول کربوژن­شده­ی ACSF به­مدت یک ساعت در درجه­ی حرارت 35 -32 درجه سانتی­گراد، انکوبه و پس از آن تا هنگام آزمایش در محلول مذکور در درجه­ی حرارت اتاق نگهداری­شدند.

برش­های تهیه­شده، در محفظه­ی ثبت قرارداده­شد و با کمک میکروسکوپ مجهز به سیستم IR-DIC (Infrared-differential interference contrast) با اپتیک­های مادون قرمز ازطریق عدسی شیئی غوطه­ور در آب مشاهده­شدند. محفظه­ی ثبت با مایع مغزی نخاعی مصنوعی ( ACSF) استاندارد کربوژنه­شده به­طور مداوم با سرعت 2-1 میلی­لیتر در دقیقه پرفیوژگردید. ACSF استاندارد حاوی (برحسب mM): NACL 4/132، KCL 5/2،  CACL22،  MgSO42،NAH2PO4 1،  NAHCO325 و گلوکز 10 بود.

ثبت جریان­های مهاری پس سیناپسی بر انگیخته وابسته به گاباA  

دراین تحقیق جریان­های مهاری پس سیناپسی برانگیخته وابسته به گاباA  (eIPSC) از جسم سلولی سلول­های هرمی CA1 هیپوکمپ با استفاده از روش کلمپ ولتاژ (whole cell voltage clamp) انجام­شد. مقاومت نوک پیپت ‏پس از پرشدن با محلول داخل سلولی، MΩ 6-5 بود. محتویات محلول داخل پیپت ثبت حاوی (برحسب mM): CsCl 140،  CaCl21،  lidocaineN-ethyl bromide(QX-314)5،HEPES 10،MgCl2  2،Mg2ATP  2،Na2GTP  2 وEGTA  10 بود. با استفاده از محلول یک مولار CsOH، pH در محدوده­ی 4/7 تا 3/7 تنظیم­شد و اسمولاریته نیز در محدوده­ی mOsm300-290 بود.

            محلول ‏داخل پیپت با استفاده از یک الکترود Ag/AgCl به آمپلی­فایر مرتبط­شد. پیپت را به سطح غشا، نزدیک و با اعمال مکشی کوچک، غشا را پاره­کرده تا حالت ‏whole cell‏ ایجادگردد.‎‏ به­­منظور تثبیت­شدن محیط داخل سلولی، ثبت حداقل 5 دقیقه بعد از پاره­شدن غشای سلول شروع­شد. مقاومت دستیابی به سلول (access resistance) کمتر از 30 مگااهم بود. این کمّیت در طی آزمایش بررسی­شد و نورون­هایی که مقاومت دستیابی آنها درطی انجام ثبت بیشتر از 20 درصد تغییرمی­کرد، مورد تجزیه و تحلیل قرارنمی­گرفتند. جریان­های غشا با کمک آمپلی فایر Multiclamp 700B ، ثبت و در کامپیوتر ذخیره­شدند. تمام ثبت­ها در دمای اتاق انجام­گرفت. قبل از انجام هر آزمایش، مشاهده­ی مستقیم سلول هرمی زیر میکروسکوپ، برای تأیید این نکته که سلول مورد بررسی یک نورون هرمی ناحیه­ی CA1 است، انجام­شد. ثبت­ها در KHz 3 ، فیلتر و با استفاده از نرم­افزار10 Pclamp ذخیره شدند.

برای ثبت eIPSC یک الکترود دوقطبی تحریک در فاصله­ی 200-300 میکرونی الکترود ثبت قرارداده و به­دنبال تحریک، پاسخ برانگیخته مهاری در یک نورون هرمی ناحیه­ی CA1 ثبت­شد. تحریک توسط پالس مربعی به­مدت 1 میلی ثانیه و شدت 5/1 برابر آستانه اعمال­می­شود. قبل از هر تحریک، آزمون سلامت سلول با اعمال موج منفی هیپرپلاریزه­کننده صورت­گرفت. 

در هنگام ثبت eIPSC نورون ابتدا با شدت­های کم، تحریک­شد و هر بار میزان تحریک، تا زمانی که اولین پاسخ ثبت­شود، افزایش­یافت. این میزان تحریک، «شدت آستانه» نامیده­شد. سپس نورون با شدتی معادل با 5/1 برابر شدت آستانه تحریک­گردید. دراین مطالعه، LFS باشدت آستانه و 5/1 برابر آن بر سطح برش مغزی اعمال­شد. پس از انجام ثبت، کمیت­های مختلف eIPSC شامل دامنه، شیب، مدت زمانی که جریان از %10 به %90 می­رسد (rise time) و ثابت زمانی بازگشت eIPSC به حالت پایه (decay time constant) در گروه­های کیندل و کنترل اندازه­گیری شدند (شکل-2).

LFS نیز با الگوی موج مربعی (20، 100 و 200 پالس) مدت زمان 1/0 میلی­ثانیه، فرکانس 1 هرتز و با شدت­های مساوی و 5/1 برابر شدت آستانه بر برش­های زنده­ی هیپوکمپ اعمال­شد. برای اعمال این تحریک از الکترود دو قطبی تحریک در فاصله­ی 200-300 میکرونی الکترود ثبت استفاده­گردید.

از آنجاکه هدف مطالعه ما ثبت جریان­های پس سیناپسی مهاری وابسته به گابا A بود، همه ثبت­ها در حضور مهارکننده­های گیرنده­های AMPA (CNQX)، NMDA (APV) و GABAB (CGP) انجام­شد. پس از پایان ثبت­ها، برای اطمینان از این که ثبت مربوط به گیرنده­ی گابا A بوده­است، از بیکوکولین (µM 50) که مهارکننده­ی گابا A می­باشد، استفاده­شد.

گروه­های آزمایشی

حیوانات به دو گروه کنترل و کیندل تقسیم­شدند. در گروه کنترل، برش­های زنده­ی هیپوکمپ از موش­هایی که هیچ تحریکی را دریافت نکرده­بودند، تهیه و جریان­های گاباارژیک درحالت پایه  و پس از اعمال الگوهای مختلف  LFSثبت شد. در گروه کیندل، حیوانات جراحی و الکترود در آمیگدال کار گذاشته­شد. تحریکات کیندلینگ اعمال­گردید تا حیوان کاملا کیندل شود. 24 ساعت پس از اعمال آخرین تحریک برش­های زنده­ی هیپوکمپ، تهیه و همانند گروه کنترل، جریان های گاباارژیک در حالت پایه  و پس از اعمال الگوهای مختلف  LFSثبت ­شد.

تجزیه و تحلیل داده­ها

کلیه­ی داده­ها به­صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM±Mean)، ارایه و تمامی تجزیه و تحلیل­های آماری با استفاده از برنامه­ی (Sigma Plot 12) و با درنظرگرفتن سطح معناداری 05/0p<  انجام­شدند. تأثیر فاکتورهای تعداد پالس LFS (20، 100 و 200)، شدت اعمال LFS (یک یا 5/1 برابر آستانه) و گروه آزمایشی (کنترل یا کیندل) بر کمیّت­های اندازه­گیری شده توسط آزمون واریانس سه­طرفه و آزمون متعاقب  Tukeyتجزیه و تحلیل­شدند. مقایسه­ی آماری پارامترهای مختلف eIPSC در شرایط قبل (ثبت پایه) و بعد از اعمال LFS در بین گروه­های مختلف با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه (One-way ANOVA) و آزمون متعاقب Tukey انجام­شد.

یافته­ها

نتایج آنالیز واریانس سه­طرفه نشان­دادند که اثرات LFS بر جریان­های گاباارژیک وابسته به تعداد پالس و شدت تحریک آن است. به­گونه­ای که اعمال LFS با الگوی 200 پالس اثرات بیشتری نسبت به اعمال 20 و 100 پالس آن از خودنشان­دادند (001/0P<). به­علاوه، اعمال LFS با شدت 5/1 برابر آستانه تأثیر بیشتری نسبت به شدت آستانه داشتند (001/0P<).

اعمال LFS با الگوی 200 پالس و در هر دو شدت یک یا 5/1 برابر آستانه، دامنه­ی eIPSC را در گروه کنترل به­طور معناداری نسبت به قبل از اعمال آن، افزایش دادند (001/0P<) (شکل-3). اعمال LFS با همین الگو فقط در شدت 5/1 برابر آستانه ثابت زمانی بازگشت eIPSC به حالت پایه را به میزان معناداری در مقایسه با قبل از اعمال تحریک افزایش دادند (001/0P<) (شکل-3). همچنین نتایج آزمون آنالیز واریانس سه­طرفه و آزمون متعاقب Tukey نشان­دادند که در این گروه اعمال LFS با الگوی 200 پالس و باشدت 5/1 برابر آستانه، دامنه­ی eIPSC را به­میزان بیشتری نسبت به اعمال آن باشدت آستانه افزایش­دادند (001/0P<).

اعمالLFS  در گروه کیندل نیز نتایج کاملا مشابه­ای داشتند. به­گونه­ای که اعمال LFS با الگوی 200 پالس و در هر دو شدت یک یا 5/1 برابر آستانه، دامنه­ی eIPSC (001/0P<) و فقط درشدت 5/1 برابر آستانه ثابت زمانی بازگشت eIPSC به حالت پایه (001/0P<) را به میزان معناداری در مقایسه با قبل از اعمال تحریک افزایش­دادند (شکل-4). اما در این گروه آزمون آنالیز واریانس سه­طرفه و آزمون متعاقب Tukey تفاوت معناداری را بین اثرات اعمال LFS با شدت­های یک یا 5/1 برابر آستانه بر کمیّت­های eIPSC نشان­ندادند.

آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و آزمون متعاقب Tukey نشان­دادند سایر کمیّت­های اندازه­گیری شده eIPSC (شیب و مدت زمانی که جریان از %10 به %90 می­رسد) تحت تأثیر اعمال LFS با الگوی 200 پالس قرارنگرفتند (05/0P>). هنگامی که این الگوی LFS باشدت برابر آستانه اعمال­شد، درصد تغییر میزان شیب eIPSC و مدت زمانی که eIPSC از %10 به %90 می رسد (در گروه کنترل به­ترتیب 15/11±09/36 و  18/20±48/27 و در گروه کیندل به­ترتیب 04/7±74/11 و 18/7 ±77/21) از نظر آماری معنادار نبودند(05/0P>). به­همین ترتیب، اعمال LFS باشدت 5/1 برابر آستانه نیز اثر معناداری بر درصد تغییر میزان شیب eIPSC و مدت زمانی که eIPSC از %10 به %90 می­رسد (در گروه کنترل به­ترتیب 32/18 ± 84/23 و 50/5 ± 47/6 و در گروه کیندل به ترتیب 35/2 ±80/5 و 86/6 ± 55/19) نداشتند (05/0P>).

هنگامی که LFS با الگوهای 100 و 20 پالس و با شدت­های یک و 5/1 برابر شدت آستانه بر برش­های زنده اعمال­شد، تفاوت آماری معناداری بین قبل و بعد از اعمال LFS در هیچ یک از کمیّت­های eIPSC در دو گروه کنترل و کیندل وجودنداشت (05/0P>).

مقایسه­ی میزان تاثیر اعمال LFS در گروه کنترل و کیندل نشان­داد که اعمال LFS با الگوی 200 پالس و باشدت 5/1 برابر آستانه در گروه کنترل دامنه­ی eIPSC را به طور معناداری بیشتر از گروه کیندل افزایش­دادند (001/0P<) اما میزان اثر بخشی آن بر  دامنه­یeIPSC  در شدت برابر آستانه و بر ثابت زمانی بازگشت eIPSC به حالت پایه در شدت 5/1 برابر آستانه در دو گروه کنترل و کیندل تفاوت معناداری نداشت (شکل-5).

افزودن بیکوکولین به محیط خارج سلولی (μM20) باعث حذف کامل پاسخ­های پس سیناپسی شد. بنابراین تمامی eIPSC  های ثبت­شده مربوط به جریان­های گاباارژیک بودند.

P در مقایسه با قبل از اعمال LFS می باشد (8-6=n). " align="left" height="815" hspace="12" width="611">

بحث

نتایج مطالعه­ی ما نشان­داد که اعمال LFS در برش­های زنده­ی هیپوکمپ سبب افزایش پاسخ­های پس سیناپسی گاباارژیک می­شود. به­گونه­ای که دامنه و ثابت زمانی بازگشت جریان به حالت پایه eIPSC را زیادمی­کند. این اثرات LFS به الگوی اعمال آن (تعداد پالس و شدت) وابسته است.

همان­گونه­که نتایج مطالعه­ی حاضر نشان­داد افزایش تعداد پالس­های LFS منجر به افزایش تأثیر آن بر جریان­های گاباارژیک می­شود. این موضوع در راستای یافته­ی قبلی است که نشان­داد افزایش تعداد پالس اثرات ضد تشنجی LFS را تقویت­می­کند(14). همچنین مطالعات قبلی آزمایشگاه ما نشان­داد که بین الگوی اعمال LFS (فرکانس، مدت پالس، شدت پالس، مدت زمان اعمال) و اثرات ضد تشنجی آن ارتباط وجوددارد(12, 13). جهان­شاهی و همکاران (11) نیز با بررسی سه فرکانس 1، 5/0 و 5 هرتز مشاهده­کردند کهLFS  در الگوی فرکانس 1 هرتز بیشترین تأثیر بازدارندگی را بر پارامترهای تشنجی دارد. قربانی و همکاران (12) نیز در فرکانس 1 هرتز بیشترین تأثیر را مشاهده­کردند که مشابه با فرکانس مورد استفاده در مطالعه­ی حاضر می­باشد. درهمین راستا گزارش­شده که هرچه تعداد پالسLFS  قبل از تحریک تتانیک بیشتر باشد، اثر مهاری آن بر القا LTP بیشتر است (17) .

نظر به اهمّیّت بالقوه­ی هیپوکمپ در انتشار امواج تشنجی درطی کیندلینگ آمیگدال، در این تحقیق LFS در این ناحیه­ی اعمال­شد تا تأثیر آن بر جریان­های گاباارژیک بررسی­شود. در بین نواحی مختلف مغز، هیپوکمپ یک مکان مهم برای گسترش و تقویت امواج تشنجی است و در صرع لوب گیجگاهی تغییرات زیادی در فعالیت نورون­های آن مشاهده­می­شود(1). علاوه براین، این ناحیه به­صورت آناتومیکی (18-20) و عملکردی (21, 22) با آمیگدال ارتباط دارد و مشخص­شده که به­دنبال کیندلینگ آمیگدال، متابولیسم گلوکز در هیپوکمپ افزایش­می­یابد(18, 23, 24). براساس این مشاهدات، پیشنهادشده­است که هیپوکمپ یک ساختار مهم در شروع، ادامه و احتمالا خاتمه­ی تشنجات ناشی از کیندلینگ آمیگدال است (23).

با وجود مشاهده­ی اثرات ضد تشنجی LFS درحیوانات آزمایشگاهی و بیماران صرعی (برای مطالعه­ی بیشتر به مقالات مروری  مراجعه­شود) (25, 26) مکانیسم دقیق عمل LFS مشخص­نشده­است. بااین­حال، به­نظرمی­رسد که مکانیسم اثر ضد تشنجی LFS  مشابه با مکانیسم­های دخیل در LTD و یا تضعیف پس از تقوی (Depotentiation) باشد (7, 27). مطالعات قبلی نشان­داده است که اعمال LFS باعث مهار LTP می­شود و پدیده­ی تضعیف پس از تقویت را به­وجودمی­آورد(8, 27). بنابراین با توجه به اثرات مهاری LFS بر LTP و مشابهت LTP با تقویت سیناپسی ناشی از کیندلینگ، ممکن­است LFS با کاهش پاسخ­دهی سیناپسی در مدارهای صرعی ازطریق مکانیسم­هایی مثل تضعیف پس از تقویت، سبب مهار گسترش فعالیت­های تشنجی شود. همچنین نتایج مطالعه­ای دیگر نشان­داده که کاربرد LFS در آمیگدال ممکن­است روند صرع­زایی را با تغییر در مدار سیستم لیمبیک مهارکند (28).

از جمله مکانیسم­های احتمالی دیگری که برای ایجاد اثرات ضدّ تشنجی LFS پیشنهادشده­است، افزایش فعالیت سیناپس های مهاری می­باشد(8). بعضی از اثرات ضدّ صرعی LFS ممکن­است ازطریق فعال­کردن گیرنده­های گابا- بنزودیازپین انجام­شود (6). نشان­داده­شده که تحریک قشر پاراهیپوکمپ در بیماران صرعی، باعث افزایش میزان گابا در بافت مغزی می­شود(29). این اثرات ضدّ صرعی LFS ممکن­است فعال­شدن پایانه­های گاباارژیک و به­دنبال آن تغییر رهایش گابا را در برداشته­باشد(30, 31). به علاوه، پیشنهاد­شده که اثرات درمانی تحریک الکتریکی در صرع موضعی نیز ممکن­است به­دلیل هایپرپلاریزاسیون ناشی از گابا در شبکه­های قشری هیپوکمپ (که در شروع و توسعه­ی تشنجات تونیک-کلونیک شرکت­می­کنند)، ایجادشود (32). نتایج حاصل از مطالعه­ی حاضر، که در واقع نخستین گزارش در مورد اثر P در مقایسه با قبل از اعمال LFS می باشد (8-6=n). " align="left" height="807" hspace="12" width="630">افزایشی LFS بر جریان­های گاباارژیک می­باشد، یافته­های فوق را تأییدمی نماید.

در این مطالعه، اثر افزایشی LFS بر جریان­های گاباارژیک با افزایش دامنه­ی  eIPSC و طولانی­شدن ثابت زمانی بازگشت eIPSC به­حالت پایه  همراه بود. افزایش دامنه­ی IPSC ممکن­است در نتیجه­ی افزایش رهایش گابا از نورون پیش سیناپسی (33)، یا افزایش گیرنده­های پس سیناپسی گابا (34) و یا تغییر درخصوصیات گیرنده­ی گابا A (که ناشی از تغییر در ترکیب زیر واحدهای گیرنده و یا فسفریلاسیون گیرنده است)، ایجادشود (35-37). در این مطالعه LFS با الگوی 200 پالس باشدت یک برابر و 5/1 برابر شدت آستانه توانست دامنه­ی پاسخ را افزایش دهد، ولی مشخص­نیست که این افزایش ناشی از تغییرات پیش سیناپسی می باشد یا تغییرات پس سیناپسی.

ثابت زمانی بازگشت eIPSC به حالت پایه­ی شاخصی از کنتیک بسته­شدن کانال کلری گیرنده­ی گاباA  و نشان­دهنده­ی مدت زمانی است که کانال باز مانده­است. بیشتربودن ثابت زمانی بازگشت جریان به حالت پایه، نشان­دهنده­ی آهسته­تربودن کنتیک بسته­شدن کانال می­باشد. بنابراین افزایش این کمیّت در مطالعه­ی ما به این مفهوم است که LFS با الگوی 200 پالس و شدت 5/1 برابر آستانه باعث­شده­است کانال مدت زمان بیشتری بازبماند و درنتیجه ورود کلر افزایش­یافته و شدت مهار نورون بیشترشود. در واقع کمیّت ثابت زمانی بازگشت جریان به حالت پایه، در سیناپس­های مهاری به­وسیله­ی فاکتورهای پیش و پس سیناپسی، ازجمله: الف) تغییرات غلظت گابا در شکاف سیناپسی درطول زمان که تحت تاثیر دانسیته­ی حامل­های گابا و میزان رهایش گابای پیش سیناپس است (38, 39)، ب) تعداد گیرنده­ی پس سیناپسی گابا A (40) و ج) ترکیب (41) و میزان فسفریلاسیون زیر واحدهای گیرنده­های سیناپسی گابا A (42)، تعیین می­شود.

کنتیک بازشدن کانال کلری گیرنده­ی پس سیناپسی گابا A  نیز به وسیله­ی اندازه­گیری مدت زمانی eIPSC از %10 به %90 پاسخ رسید و شیب آن ارزیابی­شد. نتایج نشان­داد که هیچ­کدام از الگوهای اعمال­شده بر این کمیّت­ها موثر نبود. بنابراین، می­توان این احتمال را مطرح­کرد که اعمال LFSبر کنتیک بازشدن کانال کلر اثر ندارد.

هرچند اعمال تحریک الکتریکی با فرکانس بالا هم دارای اثرات ضد تشنجی می باشد، اما امروزه سعی بر این است که در درمان صرع مقاوم به دارو از LFS، که آسیب بافتی کمتری نسبت به تحریکات الکتریکی با فرکانس بالا ایجادمی­کند، استفاده­شود. در بررسی انجام­شده توسط Albensi و همکارانش نشان داده­شد که تحریکات الکتریکی با فرکانس کم و زیاد هر دو می­توانند باعث ازبین­رفتن تخلیه­های بین حمله­ای در برش­های زنده­ی هیپوکمپ شود. حذف تحریکات الکتریکی با فرکانس زیاد موجب بازگشت مجدد تخلیه­های بین حمله­ای شد. این درحالی است که حذف LFS موجب بازگشت آن­ها نشد (43).

به­طورکلی، نتایج حاصل از این تحقیق نشان­داد که اعمال LFS به­طور وابسته به تعداد پالس و شدت باعث افزایش جریان­های مهاری گاباارژیک می­شود و این افزایش می­تواند یکی از مکانیسم­های احتمالی اثرات مهاری LFS در مدل­های آزمایشگاهی ایجاد تشنج (مانند کیندلینگ) و در بیماران صرعی باشد.

در این مطالعه این نکته که LFS با چه مکانیسم پیش و یا پس سیناپسی اثرکرده است، مشخص نیست. اما مشخص­شد که LFS ازطریق عمل­کردن بر کنتیک بسته­شدن کانال اثر خود را اعمال می­کند.

تشکر و قدردانی

حمایت مالی این تحقیق توسط مرکز علوم اعصاب کرمان و معاونت پژوهشی دانشگاه تربیت مدرس صورت­گرفته است. بدین وسیله نویسندگان مراتب تشکر خود را از این مراکز اعلام­می­دارند.

References

1. Loscher W. Animal models of intractable epilepsy. Progress in neurobiology. 1997;53(2):239-58.
2. Schmidt D, Loscher W. New developments in antiepileptic drug resistance: an integrative view. Epilepsy Curr. 2009;9(2):47-52.
3. McNamara JO. Cellular and molecular basis of epilepsy. J Neurosci. 1994;14(6):3413-25.
4. Speer AM, Kimbrell TA, Wassermann EM, D Repella J, Willis MW, Herscovitch P, et al. Opposite effects of high and low frequency rTMS on regional brain activity in depressed patients. Biol Psychiatry. 2000;48(12):1133-41.
5. Tergau F, Naumann U, Paulus W, Steinhoff BJ. Low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation improves intractable epilepsy. Lancet. 1999;353(9171):2209.
6. Lopez-Meraz ML, Neri-Bazan L, Rocha L. Low frequency stimulation modifies receptor binding in rat brain. Epilepsy Res. 2004;59(2-3):95-105.
7. Wu DC, Xu ZH, Wang S, Fang Q, Hu DQ, Li Q, et al. Time-dependent effect of low-frequency stimulation on amygdaloid-kindling seizures in rats. Neurobiol Dis. 2008;31(1):74-9.
8. Goodman JH, Berger RE, Tcheng TK. Preemptive Low‐frequency Stimulation Decreases the Incidence of Amygdala‐kindled Seizures. Epilepsia. 2005;46(1):1-7.
9. Mohammad-Zadeh M, Mirnajafi-Zadeh J, Fathollahi Y, Javan M, Ghorbani P, Sadegh M, et al. Effect of low frequency stimulation of perforant path on kindling rate and synaptic transmission in the dentate gyrus during kindling acquisition in rats. Epilepsy Res. 2007;75(2):154-61.
10. Ghotbedin Z, Janahmadi M, Mirnajafi-Zadeh J, Behzadi G, Semnanian S. Electrical Low Frequency Stimulation of the Kindling Site Preserves the Electrophysiological Properties of the Rat Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons From the Destructive Effects of Amygdala Kindling: The Basis for a Possible Promising Epilepsy Therapy. Brain Stimul. 2013;6(4):515-23.
11. Jahanshahi A, Mirnajafi‐Zadeh J, Javan M, Mohammad‐Zadeh M, Rohani R. The antiepileptogenic effect of electrical stimulation at different low frequencies is accompanied with change in adenosine receptors gene expression in rats. Epilepsia. 2009;50(7):1768-79.
12. Ghorbani P, Mohammad-Zadeh M, Mirnajafi-Zadeh J, Fathollahi Y. Effect of different patterns of low-frequency stimulation on piriform cortex kindled seizures. Neurosci Lett. 2007;425(3):162-6.
13. Shahpari M, Mirnajafi-Zadeh J, P Firoozabadi SM, Yadollahpour A. Effect of low-frequency electrical stimulation parameters on its anticonvulsant action during rapid perforant path kindling in rat. Epilepsy Res. 2012;99(1):69-77.
14. Asgari A, Semnanian S, Atapour N, Shojaei A, Moradi H, Mirnajafi-Zadeh J. Combined sub-threshold dosages of phenobarbital and low-frequency stimulation effectively reduce seizures in amygdala-kindled rats. Neurol Sci. 2014.
15. Paxinos G, Watson CW. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. New York.: Academic Press; 1986.
16. Racine R, Rose PA, Burnham WM. Afterdischarge thresholds and kindling rates in dorsal and ventral hippocampus and dentate gyrus. Can J Neurol Sci. 1977;4(4):273-8.
17. Fujii S, Kuroda Y, Miura M, Furuse H, Sasaki H, Kaneko K, et al. The long-term suppressive effect of prior activation of synaptic inputs by low-frequency stimulation on induction of long-term potentiation in CA1 neurons of guinea pig hippocampal slices. Exp Brain Res. 1996;111(3):305-12.
18. Collins RC, Tearse RG, Lothman EW. Functional anatomy of limbic seizures: focal discharges from medial entorhinal cortex in rat. Brain Res. 1983;280(1):25-40.
19. Krettek JE, Price JL. Projections from the amygdala to the perirhinal and entorhinal cortices and the subiculum. Brain Res. 1974;71(1):150-4.
20. Wyss JM, Swanson LW, Cowan WM. A study of subcortical afferents to the hippocampal formation in the rat. Neuroscience. 1979;4(4):463-76.
21. Mello LE, Tan AM, Finch DM. Convergence of projections from the rat hippocampal formation, medial geniculate and basal forebrain onto single amygdaloid neurons: an in vivo extra-and intracellular electrophysiological study. Brain Res. 1992;587(1):24-40.
22. Uno M, Ozawa N. Augmentation of synaptic responses in the dentate gyrus by daily electrical stimulation of the amygdala in cats. Brain Develop. 1986;8(4):451-3.
23. Namba H, Iwasa H, Kubota M, Hagihara Y, Yamaura A. Changes of Hippocampal Glucose Utilization Subsequent to Amygdaloid‐Kindled Generalized Seizures. Epilepsia. 1991;32(1):27-32.
24. Wasterlain C, Masuoka D, Jonec V. Chemical kindling: a study of synaptic pharmacology. Kindling. 1981;2:315-27.
25. Nagel SJ, Najm IM. Deep brain stimulation for epilepsy. Neuromodulation: Technology at the Neural Interface. 2009;12(4):270-80.
26. Theodore WH, Fisher RS. Brain stimulation for epilepsy. Lancet Neurol. 2004;3(2):111-8.
27. Ozen L, Young N, Koshimori Y, Teskey G. Low-frequency stimulation reverses kindling-induced neocortical motor map expansion. Neuroscience. 2008;153(1):300-7.
28. Wang Y, Xu Z, Cheng H, Guo Y, Xu C, Wang S, et al. Low-frequency stimulation inhibits epileptogenesis by modulating the early network of the limbic system as evaluated in amygdala kindling model. Brain Struct Funct. 2014; 219(5): 1685-96.
29. Cuellar-Herrera M, Velasco M, Velasco F, Velasco AL, Jimenez F, Orozco S, et al. Evaluation of GABA system and cell damage in parahippocampus of patients with temporal lobe epilepsy showing antiepileptic effects after subacute electrical stimulation. Epilepsia. 2004;45(5):459-66.
30. Mantovani M, Van Velthoven V, Fuellgraf H, Feuerstein TJ, Moser A. Neuronal electrical high frequency stimulation enhances GABA outflow from human neocortical slices. Neurochem Int. 2006;49(4):347-50.
31. Windels F, Bruet N, Poupard A, Urbain N, Chouvet G, Feuerstein C, et al. Effects of high frequency stimulation of subthalamic nucleus on extracellular glutamate and GABA in substantia nigra and globus pallidus in the normal rat. Eur J Neurosci. 2000;12(11):4141-6.
32. Durand DM, Warman EN. Desynchronization of epileptiform activity by extracellular current pulses in rat hippocampal slices. J Physiol. 1994;480(Pt 3):527-37.
33. Frerking M, Borges S, Wilson M. Variation in GABA mini amplitude is the consequence of variation in transmitter concentration. Neuron. 1995;15(4):885-95.
34. Nusser Z, Hajos N, Somogyi P, Mody I. Increased number of synaptic GABAA receptors underlies potentiation at hippocampal inhibitory synapses. Nature. 1998;395(6698):172-7.
35. Banks MI, Hardie JB, Pearce RA. Development of GABAA receptor-mediated inhibitory postsynaptic currents in hippocampus. J Neurophysiol. 2002;88(6):3097-107.
36. Cherubini E, Conti F. Generating diversity at GAB Aergic synapses. Trends in Neurosciences. 2001;24(3):155-62.
37. Sieghart W, Fuchs K, Tretter V, Ebert V, Jechlinger M, Höger H, et al. Structure and subunit composition of GABA_A receptors. Neurochemistry international. 1999;34(5):379-85.
38. Hefft S, Jonas P. Asynchronous GABA release generates long-lasting inhibition at a hippocampal interneuron–principal neuron synapse. Nature neuroscience. 2005;8(10):1319-28.
39. Keros S, Hablitz JJ. Subtype-specific GABA transporter antagonists synergistically modulate phasic and tonic GABAA conductances in rat neocortex. Journal of neurophysiology. 2005;94(3):2073-85.
40. Wei W, Zhang N, Peng Z, Houser CR, Mody I. Perisynaptic localization of δ subunit-containing GABAA receptors and their activation by GABA spillover in the mouse dentate gyrus. The Journal of neuroscience. 2003;23(33):10650-61.
41. Barberis A, Mozrzymas JW, Ortinski PI, Vicini S. Desensitization and binding properties determine distinct α1β2γ2 and α3β2γ2 GABAA receptor‐channel kinetic behavior. European Journal of Neuroscience. 2007;25(9):2726-40.
42. Poisbeau P, Cheney MC, Browning MD, Mody I. Modulation of synaptic GABAA receptor function by PKA and PKC in adult hippocampal neurons. The Journal of neuroscience. 1999;19(2):674-83.
43. Albensi BC, Ata G, Schmidt E, Waterman JD, Janigro D. Activation of long-term synaptic plasticity causes suppression of epileptiform activity in rat hippocampal slices. Brain research. 2004;998(1):56-64.

The Effect of Low-Frequency Stimulation on CA1 Neurons GABAergic Currents in Hippocampal Slices of Kindled Rats

Azam Asgari

PhD Student of physiology, Department of Physiology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

Saeed Semnanian

Professor, Department of Physiology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran,

Nafiseh Atapour

Professor, Neuroscience Research Center, Institute of Neuropharmacology, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran.

Department of Medicine (Royal Melbourne Hospital), Melbourne Brain Centre, University of Melbourne, Parkville, VIC, Australia

Amir Shojaei

PhD Student, Department of Physiology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

Vahid Sheibani

Professor, Neuroscience Research Center, Institute of Neuropharmacology, Kerman University of Medical Sciences, Kerman, Iran

Javad Mirnajafi-Zadeh

Professor, Department of Physiology, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran