مطالعه­ی خواص آنتی باکتریال نانوذرات نقره­ی تولید شده توسط آنزیم آلفاآمیلاز باکتریایی

نسرین ملانیا¹*، فرنگیس غریب²، رامین رستمی تقی دیزج³، میترا خیرآبادی⁴

¹ استادیار بیوشیمی، دکتری بیوشیمی, گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه حکیم سبزواری, سبزوار, ایران

² دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه حکیم سبزواری, سبزوار, ایران

³ دانشجوی کارشناسی ارشد بیوشیمی، گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه حکیم سبزواری, سبزوار, ایران

⁴ استادیار بیوفیزیک، دکتری بیوفیزیک, گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه حکیم سبزواری, سبزوار, ایران

* نشانی نویسنده مسئول: سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، نسرین ملانیا

E-mail: mollania_n@yahoo.com

وصول:1/9/94، اصلاح:11/10/94، پذیرش:15/12/94

مقدمه

نقره عنصری سفید و براق فلزی می­باشد. پودر نقره به نظر هیپوکراتیس (Hippocrates)، پدر علم پزشکی نوین، دارای اثرات شفادهندگی و ضدمریضی بوده و در لیست درمانی برای زخم­ها قرار داشت. ترکیبات نقره به عنوان سلاح اصلی در مقابل زخم­های عفونی در جنگ جهانی اول بود تا اینکه آنتی بیوتیک­ها تولید شدند. در سال 1884 پزشکان متخصص آلمانی، محلول چشمی یک درصد نیترات نقره را برای جلوگیری از Gonococcal Ophthalmia Neonatorum معرفی نمودند که گفته می­شود، اولین مقاله­ی علمی مستند برای کاربردهای پزشکی نقره می­باشد. از زمان امپراطوری­های گذشته، نقره برای محافظت آب آشامیدنی از آلودگی استفاده می­شد. در قرن 18، مهاجران به آمریکا تکه­های نقره را برای جلوگیری از آلودگی شیر در آن می­انداختند.طی جنگ جهانی اول، برای حفاظت جراحات از عفونت، ورقه نقره به کار می­رفت(1). روشی که کماکان استفاده می شود.در دهه 1970، ناسا مخازن نقره­ای را برای حفظ پاکیزگی آب آشامیدنی در سفینه فضایی به کار می­برد، این کاربردها خواص آنتی­بیوتیک و ضد باکتری نقره را نشان می­دهند. با کشف آنتی­بیوتیک­ها در قرن 20، از نقره کمتر در اهداف پزشکی استفاده شد، تماس طولانی مدت با نقره و ترکیبات نقره سبب ایجاد لکه­های برگشت­ناپذیر در پوست و چشم گردید و عدم توانایی در از بین بردن این مشکلات باعث شد که استفاده از نقره به فراموشی سپرده شود(1).

طی قرن اخیر به خاطر استفاده بیش از حد آنتی بیوتیک ها،برخی باکتری­ها نظیر  MRSAوVRSA که از استافیلوکوک­ها هستند، نسبت به آن­ها مقاومت پیدا کرده­اند.آسیب پذیری آنتی بیوتیک­های زیستی به عنوان دارو،دوباره علاقه به خواص آنتی­بیوتیکی نقره را زنده کرده است.و با پیشرفت علم نانو و ایجاد نانوذرات نقره با داشتن خواص و مورفولوژی جدید، نقره توانست جایگاه از دست رفته خود را بازیابد و نگاه­ها بار دیگر به سمت نقره و خواص ضد باکتری آن معطوف گردد(2, 3). با افزایش نسبت سطح به حجم نانوذرات فلزی نقره، می­توان خواص فیزیکی و شیمیایی آن را تغییر داد و کارایی­شان را در نابودی باکتری­ها افزایش بخشید. به نظر می رسد که نانوذرات فلزی نقره، نقش مهم و رو به جلوییدر مبارزه علیه میکروب­ها درآینده بازی خواهند کرد(4).

نانوذرات نقره از روش­های شیمیایی و فیزیکی مختلفی سنتز می­شوند، اما اکثر این روش­ها می­توانند برای سلامتی انسان و محیط زیست به علت تولید مواد جانبی مضر،آسیب رسان باشند و معمولا روش­هایی پرهزینهای نیزهستند. بیوسنتز نانوذرات توسط روش­های زیستی می توانندجایگزین مناسبی برای غلبه بر  مشکلات ناشی از سایر روش­های سنتزیباشندو به نظر می­رسد که سازگاری بهتری با بدن داشته باشند(5, 6).

روش کار

1.2.              سنتز زیستی نانوذرات نقره و تعیین ویژگی های نانوذرات تولید شده

ابتدا مقداری از آنزیم آلفاآمیلاز خالص حاصل از باکتری  Bacillus sp. ASM1, که با کد KC693767.1 در پایگاه بانک ژنی در ncbi ثبت شده است, را همراه با غلظت نهایی یک میلی مولار از نیترات نقره (AgNo₃) در انکوباتور در دمای80 درجه به مدت 40 ساعت قرار دادیم در حالیکه به شاهد نیترات نقره اضافه نشد. باید در اینجا بیان نمود که آنزیم آمیلاز خالص شده در دمای 80 درجه سانتیگراد هم هنوز قسمت عمده ای از فعالیت خود را حفظ میکند.  با مشاهده اولین تغییر رنگ نمونه ها نسبت به شاهد با دستگاه اسپکتروسکوپی UV-vis خوانده شد. تغییر رنگ محلول از زرد کمرنگ به قهوه ای نشان دهنده تشکیل نانوذرات نقره و احیا Ag⁺  به Ag⁰ است. پس از تکمیل فرایند تولید نانوذرات, محلول کلوئیدی حاصل با استفاده از سانتریفیوژ در rpm18000 جدا و محلول رویی دور ریخته شد. بعد با آب دیونیزه سه بار سانتریفیوژ را تکرار نمودیم تا نانوذرات ته نشین شده پراکنده شوند. در نهایت سوسپانسیون تولید شده خشک شد و برای مطالعات بیشتر استفاده شد.

برای شناسایی نانوذرات در ابتدا به کمک طیف سنجی جذبی دربازه ی nm 400 تا nm 500 که ناحیه‌ی جذب نانوذره ی نقره است، تولید زیستی نانوذرات را بررسی نمودیم. در ادامه برای تعیین اندازه نانوذرات نقره از روش روش پراکنـدگی دینامیـکی نور (DLS) استفاده نمودیم. با استفاده از تابش نور مرئی با طول موج 633 نانومتر به نمونه که در آب حل شده، اندازه‌ی ذرات بدست آمد. همچنین با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (SEM) شکل و اندازه نانو ذرات، از سوی شرکت سازنده بررسی و تعیین گردید.

2.2. آزمون ضد میکروبی نانوذرات نقره

باکتریهای مورد استفاده جهت انجام آزمایشات ضد باکتریایی شامل اشرشیاکلای (ATCC 25922) و استافیلوکوکوس اورئوس(ATCC 25923) بودند که بصورت فریز خشک نگهداری شده بودند. این باکتریها از آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده پزشکی تهیه شده بودند. نمونه  های  باکتریایی  بر  روی  محیط  های  کشت اختصاصی مانیتول سالت آگار و بلاد آگار مجددا کشت شدند. پس از طی مدت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، از نمونه باکتریای برای تهیه سوسپانسیون باکتریایی استفاده شد (7, 8).  اشریشیاکلی  باسیل  گرم  منفی  است  که  عامل بسیاری از عفونت ها و مسمومیت ها به ویژه عفونت ادراری می باشد. استافیلوکوک اورئوس کوکسی گرم مثبت و بی‌هوازی اختیاری است که به عنوان یکی از ۵ عامل شایع ایجاد کننده عفونت‌های بیمارستانی به ویژه عفونت‌های زخم پس از جراحی است.

برای تعیین پارامتر  MIC (حداقل غلظت بازدارنده­ی رشد) از روش Broth Microdilution در این تحقیق استفاده گردید. بدین منظور ابتدا محلول نیم مک­فارلند (108× 5/1-1 عدد باکتری در هر میلی لیتر (Colony-Forming Unit (CFU) تهیه گردید. به این ترتیب که محلول شماره­ی 1 یعنی 1.175% از باریوم­کلراید دوآبه (BaCl₂.2H₂O) و محلول شماره­ی2 یعنی 1% اسیدسولفوریک (H₂SO₄) تهیه شد. سپس 0.5 میلی­لیتر از محلول شماره­ی 1 به 99.5 میلی­لیتر از محلول شماره­ی 2 اضافه شد. محلول حاصل محلول نیم­مک­فارلند است و از مقایسه­ی جذب نمونه­ی پیش­کشت با این محلول در 620 نانومتر می­توان برای تخمین تعداد سلول­های باکتری در حین القا استفاده کرد و میزان جذب در محدوده 1/0 – 08/0 تنظیم شد  (9, 10). پس از تهیه­ی محیط­های مورد نیاز در لوله­های آزمایش و ایجاد غلظت­های مختلف نانوذره­ی نقره با استفاده از روش رقیق­سازی، با اضافه­کردن محیط کشت فاقد باکتری به پیش­کشت، کدورت پیش­کشت به کدورت محلول نیم مک­فارلند رسانده شد. سپس از این محیط به مقدار 500 میکرولیتر به محیط­های کشت اضافه شد. یک لوله­ی فاقد نقره هم به عنوان کنترل، کشت داده شد. سپس این لوله­ها در انکوباتور در دمای C°37 و هوادهی  rpm180 به مدت 24 ساعت قرار داده شدند. پس از گذشت این زمان، رشد قابل رویت باکتری­ها در هرکدام از این لوله به عنوان معیاری از حداقل غلظت متوقف کننده­ی رشد در نظر گرفته شدند.

نتایج

1.3.              تولید نانو ذرات نقره

تولید نانوذرات نقره توسط آنزیم آلفا آمیلاز خالص مورد بررسی قرار گرفت. برای اینکار ازUV-Visible  استفاده شد که نتایج آن با گزارشات جهانی مطابقت دارد. طیف جذبی نانوذرات نقره دارای یک قله پلاسمونی سطحی پهن درطول موج جذب 500-400  نانومتر می باشند. جذب تشدید پلاسمون سطحی در 426 نانومتر برای نانوذرات نقره رخ میدهد.

پراکندگی نور دینامیکی روشی فیزیکی است که برای تعیین توزیع ذرات موجود در محلول ها و سوسپانسیون استفاده می شود. این روش غیرمخرب و سریع برای تعیین اندازه ذرات در محدوده ی چند نانومتر تا میکرون به کار می رود. در فناوری های اخیر، ذراتی با قطر کمتر از نانومتر نیز با این روش قابل اندازه گیری هستند.این روش به برهمکنش نور با ذره بستگی دارد.

2.3. تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی

غلظت­های مختلف نانوذره (100-200-300) که بر اساس مقدار MIC بدست آمد، انتخاب شد.بعد از اضافه نمودن نانوذرات به سلول­های باکتری، در زمان­های مختلف میزان جذب سلول­ها خوانده شد و نمودار رشد باکتری­ها نسبت به زمان بدست آمد. در این مرحله از یک لوله به عنوان کنترل نیز استفاده گردید که فاقد نانوذره نقره بود. مقدار MICو MBC بدست آمده در جدول3-1 نشان داده شده است. بر اساس مقدار MIC بدست آمده منحنی رشد باکتری­های فوق بدست آمد (شکل 3-3, A و B).

منحنی رشد سلول­های  باکتری­ تیمارشده با نانوذره نقره نشان می­دهد که نانوذرات می­توانند رشد و تولید سلول­های باکتری را مهار کنند. منحنی رشد باکتری S.aureus نشان می­دهد رشد سلول­های باکتری با 200 و 300 ماکروگرم بر میلی لیتر نانوذره نقره مهار شده و بعد از 10 ساعت تقریبا همه­ی سلول­های باکتری از بین رفته­اند. منحنی رشد سلول­های باکتری با 100 نانوذره نقره کاهش سرعت رشد را در مقابل گروه کنترل به خوبی نشان می­دهد. در مورد منحنی رشد باکتری E.Coli مشاهده شد که بعد گذشت 12 ساعت تقریبا تمامی باکتریها از بین رفته اند و مقدار 200 و  300 مهار رشد یاکتری را نشان می­دهد و در حضور مقدار 100 نانوذره نقره، رشد سلول­های باکتری نسبت به گروه کنترل

بحث و نتیجه­گیری

باظهور و افزایش ارگانیسم­ها ی میکروبی مقاوم به آنتی بیوتیک­های متعدد، وهمچنین ضرورت  برکاهش هزینه­های مراقبت­های بهداشتی، تولید مواد ضد میکروبی با هزینه­های کمتربه نیازی گریز ناپذیر برای جوامع بشری امروزی تبدیل شده است اثرات ضدباکتریایی نقره  قدمتی به اندازه دوران باستان تا به امروز دارد.نقره درحال حاضربرای کنترل رشد باکتری در موارد مختلفی،ازجمله دهان ودندان وزخم وسوختگی مورد استفاده قرار می­گیرد(11, 12). این نانوذرات معدنی نسبت به سایر مواد شیمیایی ضدمیکروبی مزیت دارند، چون مواد شیمیایی دارای مقاومت دارویی هستند. به طور کلی مکانیسم عمل این مواد به نحوه­ی اتصال این ذرات به سطح باکتری و متابولیسم داخل ارگانیسم مرتبط است. هر چند استفاده از این ذرات هم محدودیت­های ویژه­ای را به همراه دارد (11).

ما در این تحقیق از دو باکتری­ گرم مثبت و منفی که دارای تفاوت در ساختارغشایی هستند و آن هم تفاوت در ضخامت لایه­ی پپتیدوگلیکانی­شان است، استفاده نمودیم. به طور کلی باکتری­های گرم مثبت نسبت به مواد آنتی باکتریال دارای حساسیت کمتری هستند. زیرا لایه­­ی پپتیدوگلیکان در آن­ها در مقابل نفوذ نانوذرات نقره، حفاظ مستحکم تری است که این مسئله را می توان با مقایسه اثر نانوذره نقره بر روی منحنی رشد  Staphylococcus aureus به عنوان یک باکتری گرم مثبت در مقابل Escherichia Coli   به عنوان یک باکتری گرم منفی به خوبی قابل مشاهده کرد.

مکانیسم ضدباکتریایی یون نقره به خوبی مشخص شده است. بار مثبت یون نقره در این فعالیت بسیار مهم است، زیرا امکان واکنش­های الکترواستاتیکی با بارهای منفی موجود در غشا را خواهد داشت و از این طریق به غشا متصل می­گردد. یونهای نقره سبب آزاد شدن یون­های K+ از باکتری می­شود. بنابراین پلاسما باکتری و غشای پلاسمی باکتری که مرکز تجمع آنزیم­ها و DNA است، هدف یون­های نقره قرار می­گیرد. هنگامی که رشد باکتری مهار شد، یون­های نقره در واکوئل و دیواره­ی سلولی مانند گرانول رشد می­کنند. آن­ها تقسیم سلولی را مهار و به دیواره­ی سلولی و محتوای سلولی آسیب می­رسانند. اندازه­ی سلول کوچک می­شود و ساختار دیواره­ی سلولی وغشای پلاسمایی و محتوای سلولی دچار اختلال می­گردد.  خاصیت آنتی­باکتریال نانوذره نقره در باکتری­های گرم منفی به غلظت نانوذره و تجمع به صورت Pits در دیواره­ی سلولی بستگی دارد. این نانوذرات تجمع یافته در غشا  سبب نفوذپذیری غشا و مرگ تدریجی سلول می­شوند.

امرو (Amro)و همکارانش نشان دادند که کاهش فلزی ممکن است سبب ایجاد چاله­هایی در غشا خارجی و تغییرنفوذپذیری غشا گردد که این امر خود باعث افزایش تصاعدی مولکول­های لیپوپلی­ساکاریدها و پروتئین­های غشا می­شود. البته هنوز نحوه­ی اتصال نقره به ترکیبات دیواره­ی سلولی درحال بررسی است. البته گزارشات جدید توسط Danilczuk و همکارانش توسط تشدید پارامغناطیسی الکترون، از آزادسازی رادیکال­های آزاد توسط نانوذرات نقره اطلاع می دهد و بیان میکنند که آسیب غشایی دیواره ممکن است به خاطر اثرات تخریبی این رادیکال­های آزاد باشد. رادیکال­های آزاد ترکیبات حدواسط با طول عمر کوتاه بوده که دارای یک یا چند الکترون جفت نشده در لایه­ی آخر الکترونی خود هستند. به همین علت بسیار واکنش­پذیر بوده و برای بدست اوردن الکترون به مولکول­های پایدار مجاور خود حمله کرده وسبب اکسایش آن­ها می­شوند. مولکولی که الکترون خود را از دست داده، خود تبدیل به یک رادیکال آزاد شده و این چرخه همچنان ادامه می­یابد(12).

مطالعات  in vitroنشان میدهد مکانیسم اصلی عملکردآن­ها برپایه تغییردادن سطحROS  درون سلول­هااست. بعضی از محققان گزارش داده­اند که ROS به طور طبیعی در داخل یا خارج سلولی می­تواند وجود داشته باشد. در شرایط خاص افزایش مقدار ROS می­تواند استرس اکسیداتیو در سلول ایجاد کند. استرس اکسیداتیو نه تنها می­تواند سبب آسیب غشای سلولی گردد. بلکه می­تواند سبب آسیب به DNA و پروتئین­ها سیستم­های درون سلولی از قبیل زنجیره­ی تنفسی گردد، نانوذرات قادرند تا سطح ROSدرون سلول را تغییردهند ورشدوتمایزانواع سلولها راتحت تاثیرقراردهند مطالعات مختلف در محیط­های in vitro  و in vivo پیشنهاد می­کنند که آن­ها قادرند گونه­های فعال اکسیژن ROS را تولید کنند و بنابراین می­توانند بر روی غلظت کلسیم درون سلولی، فعال نمودن فاکتورهای رونویسی و ایجاد تغییر در سایتوکین­ها  نقش داشته باشند. ROS  از طریق روش­های مختلفی نظیر: آسیب رساندن به DNA، تداخل با مسیرهای سیگنالینگ سلولی، تغییرات در روند رونویسی ژن­ها و... غیره می­توانند به سلول_­­­ها آسیب وارد کنند(13).

به طورکلی نانوذرات سنتز شده از طریق زیستی دارای پایداری بالاترنسبت به سایر نانوذراتبوده و همچنین ترکیبات سازگار با محیط زیست می باشند و هزینه­ی کمتری برای تولید نسبت به سایر روش­های سنتزی شیمیایی و فیزیکی نیاز دارند(14, 15) و با توجه به خاصیت آنتی باکتریال خوبی که از خود نشان می­دهند، می­توانند جایگزین­های مناسبی برای انواع آنتی بیوتیک­ها باشند.

References

1. Tolaymat TM, El Badawy AM, Genaidy A, Scheckel KG, Luxton TP, Suidan M. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: a systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers. Sci Total Environ. 2010;408(5):999-1006.
2. Ahamed M, AlSalhi MS, Siddiqui MK. Silver nanoparticle applications and human health. Clin Chim Acta. 2010;411(23-24):1841-8.
3. Abou El-Nour KM, Eftaiha A, Al-Warthan A, Ammar RA. Synthesis and applications of silver nanoparticles. Arab J chem. 2010;3(3):135-40.
4. Stark WJ. Nanoparticles in biological systems. Angewandte Chemie International Edition. 2011;50(6):1242-58.
5. Aiad I, El-Sukkary MM, Soliman E, El-Awady MY, Shaban SM. In situ and green synthesis of silver nanoparticles and their biological activity. J Ind Eng Chem. 2013; 20(5): 3430-9.
6. Vidhu V, Aromal SA, Philip D. Green synthesis of silver nanoparticles using Macrotyloma uniflorum. Spectrochim Acta A. 2011;83(1):392-7.
7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline. Document M26-A. Wayne, PA: NCCLS; 1999.
8. FDA. Division of Antiinfective and Ophthalmology Drug Products (HFD-520)—Microbiological data for antibacterial drug products—development, analysis, and presentation. 2005.
9. McFarland  J. Nephelometer:  an  instrument for  media  used  for  estimating  the  number  of bacteria  in  suspensions  used  for  calculating the  opsonic  index  and  for  vaccines, JAMA. 1907; 14:1176-8.
10. Ruparelia JP, Chatterjee AK, Duttagupta SP, Mukherji S. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomater. 2008;4(3):707-16.
11. Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim J-H, Park SJ, Lee HJ, et al. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanomedicine. 2007;3(1):95-101.
12. Zhang L, Gu FX, Chan JM, Wang AZ, Langer RS, Farokhzad OC. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clin Pharmacol Ther. 2008;83(5):761-9.
13. Kim S-H, Lee H-S, Ryu D-S, Choi S-J, Lee D-S. Antibacterial activity of silver-nanoparticles against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Korean J Microbiol Biotechnol. 2011;39(1):77-85.
14. Mishra A, Sardar M. Alpha-amylase mediated synthesis of silver nanoparticles. Science of Advanced Materials. 2012;4(1):143-6.
15. Kalishwaralal K, Gopalram S, Vaidyanathan R, Deepak V, Pandian SRK, Gurunathan S. Optimization of α-amylase production for the green synthesis of gold nanoparticles. Colloids Surf B Biointerfaces. 2010;77(2):174-80.

*Nasrin Mollania

Assistant Professor of Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran.

Farangis gharib

MSc student of Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran.

Ramin Rostami- Taghi Dizaj

MSc student of Biochemistry, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran.

Mitra kheirabadi

Assistant Professor of Biophysic, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran.