مقاله پژوهشی

 

 

 

بررسی اثر مشتق جدید کورکومین روی مهار تشکیل تجمعات سمی و جلوگیری از تخریب یادگیری و حافظه فضایی موش صحرایی

 

حسن رامشینی¹ ، عبدالله مهرآبادی¹ ، علیرضا مسلم²*

¹دانشگاه پیام نور، گروه علمی زیست شناسی، تهران ، ص.پ 4697-19395 –ج.ا.ایران

²استادیار گروه بیهوشی، مرکز تحقیقات سلامت سالمندان، دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، سبزوار، ایران

 

*نشانی نویسنده مسؤول: سبزوار، دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، مرکز تحقیقات سالمندان، دکتر علیرضا مسلم

E-mail: alirezamoslem@gmail.com

چکیده

زمینه و هدف:تجمعات پروتئین آمیلوئید بتا (Aβ) که سازنده اصلی پلاک­های سنیل می­باشد یکی از عوامل مهم پاتولوژیکی است که منجر به بیماری آلزایمر می گردد. ترکیباتی که قادر به مهار تشکیل فیبرهای Aβ بشود و یا باعث کاهش سمیت ناشی از این فیبرها گردند ممکن است ارزش درمانی برای بیماری آلزایمر داشته باشند. در حالی­که انتظار می­رود کورکومین به­عنوان یک دارو در درمان آلزایمر تجویز شود اما به­علت پایداری پایین آن این امر میسر نشده است. در مطالعه حاضر اثر مهاری 2, 6-bis(3,4-dimethoxybenzylidene)-1- cyclohexanone که یک مشتق جدید و پایدار از کورکومین است روی تجمع و سمیت لیزوزیم تخم­مرغ (HEWL) و همچنین روی یادگیری و حافظه فضایی موش صحرایی بررسی شده است.

مواد و روش­ها: تعداد 30 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن 250-280 گرم به 5 گروه کنترل، دریافت­کننده اسکوپولامین، دریافت­کننده فیبرهای لیزوزیم، دریافت­کننده فیبرهای لیزوزیم تشکیل شده در حضور کورکومین و یا مشتق کورکومین تقسیم شدند. تمام موش­ها به کمک ماز آبی تحت آزمون یادگیری و حافظه فضایی قرار گرفتند.

یافته­ها: نتایج نشان داد که گروه­های دریافت­کننده تجمعات لیزوزیم تشکیل شده در حضور کورکومین و یا مشتق آن سکوی پنهان را نسبت به گروه کنترل در زمان کمتر و با طی مسافت کمتری پیدا کردند. تزریق تجمعات آمیلوئیدی لیزوزیم به هیپوکامپ موش صحرایی باعث کاهش حافظه فضایی موش صحرایی شد. در حالی که در حضور کورکومین و مشتق آن تجمعات لیزوزیم تشکیل یافته، غیر سمی بوده و در اثر تزریق به موش صحرایی روی یادگیری و حافظه فضایی تأثیر ندارند.

نتیجه­گیری: این مشاهدات پیشنهاد می­کند که کورکومین و یا مشتق آن ممکن است با نفوذ در محل تولید پلاک آمیلوئیدی باعث مهار تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی گردد. از طرفی این مطالعه اهمیت استفاده از پروتئین مدل را به­عنوان یک ابزار قوی برای مطالعه بیماری آلزایمر نشان می­دهد.

 

 

مقدمه

            بیماری آلزایمر، عمومی­ترین شکل دمانس است که به لحاظ بافت شناسی با تجمع رسوبات خارج سلولی آمیلوئید آ-بتا (βA) و رسوبات داخل سلولی پروتئین تاو (tau) در مغز همراه است (1). مطالعات زیادی نشان داده­اند که آ-بتا (βA) نقش اصلی را در بیماری­زایی آلزایمر ایفا می­کند (3,2). همچنین نشان داده شده که این پروتئین نقش مهمی در از بین رفتن ادراک، التهابات نورونی و مرگ سلولی که در بیماران آلزایمری مشاهده می­شود ایفا می­کند. علی­رغم مطالعات گستردهای که امروزه روی این بیماری صورت گرفته ولی متأسفانه درمان آن موفقیت­آمیز نبوده است. گیاهان دارویی به دلیل اثرات درمانی مناسب، همراه با عوارض جانبی کمتر در کنترل و درمان بیماری‌ها از قرن‌ها پیش مورد استفاده پزشکی بوده‌اند.

            نکته اصلی در درمان حافظه و یادگیری، لزوم درمان طولانی مدت است که زمینه‌ی بروز عوارض جانبی متعدد داروها شیمیایی را بیشتر فراهم می‌کند. از این‌رو توجه دوباره به طب سنتی و داروهای گیاهی با هدف دستیابی به داروهای کم‌خطر و با حداقل عوارض جانبی آشکارتر می‌شود (5,4). مطالعات نشان داده است که کورکومین (دارای ساختار پلی فنلیک)  ماده مؤثره ادویه زرچوبه (Curcumalonga) دارای خواص متعدد درمانی از جمله اثر ضد ویروسی، ضد قارچی، ضد التهابی، ضد سرطانی (7,6) و همچنین دارای نقش مهمی در کاهش اثرات تخریبی آمیلوئیدهای Aβ در invitro دارد (9,8). به­علاوه اینکه کورکومین باعث مهار یا بهبود پروسه­های پاتولوژیکی که به­صورت وابسته به سن باعث تخریب یادگیری و ایجاد دمانس و تغییرات خلق و خو شده، می­گردد(8). نشان داده شده که کورکومین اثرات حفاظتی از سلول­های نورونی در تعدادی از مدل های آلزایمری دارد و ممکن است این نقش را با جلوگیری از تخریب سیناپس­ها انجام دهد (11).Hoppe و همکاران نشان داده اند که آمیلوئیدهای آ-بتا دارای اثرات تخریبی روی فعالیت سیناپس­ها درقطعات هیپوکمپ در روی محیط کشت دارد و این اثرات بوسیله کورکومین خنثی می­شود (12).

گزارش­ها نشان می­دهد که مصرف خوراکی کورکومین باعث افزایش حافظه و یادگیری در موش­های پیر می­شود (14,13) و از طرفی این ماده نقش حفاظتی در مقابل استرس­هایی که باعث تخریب ادراک شده و همچنین آسیب­های مربوط به استرس­های اکسیداتیو دارد (15). اعمال بیولوژیکی متنوع و عدم سمیت کورکومین برای سلول­ها آن را به­عنوان یک ترکیب با ارزش و دارای پتانسیل درمانی به­عنوان دارو معرفی می­کند (16). متأسفانه مطالعات نشان می­دهد کورکومین در شرایط pH خون دارای پایداری لازم نیست و همچنین به­دلیل داشتن گروه­های هیدروکسی در ساختار آن توسط آنزیم­های  کبد و کلیه متابولیزه شده و از بدن دفع می­گردد و در نتیجه از نظر غلظت در دسترس (bioavailability) را برای اثر بخش بودن در مغز را ندارد (18,17).

Chakraborti و همکارانش تعدادی از آنالوگ­هایی کورکومین را طراحی کرده­اند که بخش دی کتون آن با حلقه ایزوکسازول جایگزین شده و نشان داده­اند که ترکیبات جدید دارای ساختار پایدار بوده و تا حدودی نقش کورکومین را نیز ایفا می کنند (19). Reinke و همکاران تعداد زیادی از ترکیبات مشابه کورکومین را مورد آزمایش قرار داده اند و نشان داده­اند که ترکیباتی که از لحاظ ساختاری یعنی حلقه­های جانبی و طول رابط بین حلقه ها مشابه کورکومین است دارای اثرات بهتری است (20). بر همین اساس ما نیز در مطالعه اخیرآنالوگ­هایی از کورکومین را طراحی کردیم که ضمن اینکه ساختار پایه کورکومین حفظ شده اما با تغییر در جایگاه­هایی که باعث ناپایداری آن می­گردد موفق شدیم ترکیبات آنالوگ پایدار را پیشنهاد نماییم. از طرف دیگر فعالیت ضد آمیلوئیدی آنها را بررسی کرده و نشان دادیم که این ترکیبات پایدار در محیط in vitro قادر به مهار تشکیل فیبرهای لیزوزیم شده و همچنین سمیت سلولی ناشی از این فیبرها را نیز کاهش می­دهد (21).

در مطالعه حاضر اثر یکی از موثرترین این آنالوگها را روی حافظه فضایی موش صحرایی با اثر کورکومین مقایسه می­نماییم. مطالعات نشان داده است که اثرات نورولوژیکی آمیلوئیدهای پروتئینهای مدل از جمله لیزوزیم در اثر تزریق در مغز مشابه با الیگومرهای Aβ است و می­تواند باعث تخریب حافظه فضایی شود (22) به همین دلیل در مطالعه حاضر از لیزوزیم سفیده تخم­مرغ (HEWL) به­عنوان یک پروتئین مدل استفاده شد.

 

مواد و روش­ها

این مطالعه روی 30 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد ویستار با وزن 250-280 گرم انجام شد که از مؤسسه تحقیقاتی پاستور تهران خریداری شد و پس از انتقال به حیوان­خانه دانشگاه علوم پزشکی سبزوار، تعداد 4 سر در هر قفس قرار گرفتند و اجازه داده شد تا با محیط جدید سازگار شوند و به سن و وزن مورد نظر برسند. اصول اخلاقی کار بر روی حیوانات بر اساس دستور کار کمیته اخلاقی دانشگاه علوم پزشکی (کد مجوز اخلاق:  IR.MEDSAB.REC.1394.102) رعایت گردید.

1-2-روش تهیه آمیلوئید سفیده تخم مرغ: برای القای تشکیل آمیلوئید mg/ml2پروتئین لیزوزیم سفیده تخم مرغ (خریداری شده از شرکت سیگما ) در بافر گلایسین با 5/2 pH= به مدت 48 ساعت همراه با همزدن مداوم در دمای 57 درجه سانتیگراد قرار گرفت (21). سپس ویال حاوی ماده فوق در دمای 4 درجه سانتیگراد به­مدت 25 دقیقه و با 13000RPM  سانتریفوژ شد؛ سپس محلول رویی به آرامی توسط سمپلر (گیلسون، فرانسه) برداشته شد به­طوری­که هرگز سر سمپلر به دیواره ویال برخورد نمی­کرد. پس از آن به مقدار محلول رویی برداشته شده نرمال سالین به ویال اضافه شد به­طوری­که از کناره­های ویال اضافه می­شد و چندین بار عمل سمپلینگ انجام شد. سپس از این ماده تحت عنوان آمیلوئید تشکیل شده در غیاب کورکومین و یا آنالوگ آن مورد  استفاده قرار گرفت.

2-2- روش تهیه آمیلوئید لیزوزیم در حضور کورکومین و آنالوگ شماره 3: کورکومین و آنالوگ آن با غلظت 50 میلی مولار تهیه شد و مقدار مشخصی از این دو ترکیب به ویال­های تهیه آمیلوئید (مطابق روش تهیه آمیلوئید) اضافه شد تا غلظت نهایی آنها به 8/0 میلی مولار برسد. مطالعات قبلی ما نشان می داد که این غلظت بیشترین اثر را دارد (21). بعد از 48 ساعت انکوباسیون قبل از تزریق، ویالها در دمای 4 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه و با قدرت 13000   RPM سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی (حاوی کورکومین یا آنالوگ کورکومین ) دور ریخته شد و به همان حجم نرمال سالین اضافه گردید و چند بار عمل سمپلینگ انجام شد. سپس از این ماده تحت عنوان آمیلوئید تشکیل شده در حضور کورکومین و یا آنالوگ آن مورد  استفاده قرار گرفت (21).

3-2-انجام تزریقات:

حیوانات پیش از عمل جراحی، با تزریق درون صفاقی کتامین  100و زایلزین  10 بیهوش شدند. سپس موهای سر حیوان قیچی شد. پس از آن سر موش صحرایی در دستگاه استریوتاکس ثابت شد و پس از بتادینه  نمودن سر، برشی طولی در حد فاصل چشمها و گوشها ایجاد گردید و سطح روی جمجمه با کمک پنبه الکلی تمیز شده و نقطه برگما مشخص گردید. سپس بر اساس اطلس پاکسینوس هیپوکامپ روی سطح جمجمه نسبت به  برگما با مختصات mm3/3ap= -،mm  2l= و mm 3/3v =  با کمک دستگاه استریوتاکس تنظیم و علامت­گذاری شد. پس از سوراخ کردن محل علامت­گذاری شده به کمک دریل دندانپزشکی، کانول گذاری توسط سر سرنگ شماره  23 انجام شد و سپس به­وسیله محلول غلیظ سیمان دندانپزشکی کانول راهنمای تزریق در جایگاه خود فیکس شد. جهت جلوگیری از عفونت­های بعدی محل جراحی با آنتی­بیوتیک پنی­سلین آغشته شده و در انتها بخیه زده شد و سپس حیوان برای گذراندن دوره هفت روزه بهبودی به حیوان خانه منتقل شد. هفت روز پس از جراحی تزریقات هر حیوان انجام شد. تزریق مواد مورد نظر در همه گروه­ها به مقدار 1 میکرولیتر با کمک سرنگ همیلتون توسط پمپ میکرواینجکشن از طریق کانول راهنما به صورت داخل هیپوکامپی طی پنج دقیقه انجام شد. گروه­بندی حیوانات به شرح ذیل انجام شد.

1- گروه کنترل نیم ساعت قبل از انجام آزمون رفتاری ماز آبی یک میکرولیتر نرمال سالین تزریق شد.

2- گروه دریافت­کننده اسکوپولامین که از این به بعد به اختصار گروه اسکوپولامین نامیده می­شود: اسکوپولامین یک آنتاگونیست گیرنده­های موسکارینی است که باعث اختلال موقت در حافظه فضایی شده و مدلی شبیه بیماری آلزایمر ایجاد می­کند. ابتدا g/ratµ 3 ماده اسکوپولامین هیدروبروماید (خریداری شده از شرکت سیگما) در یک میکرولیتر نرمال سالین 9/0 درصد حل شده و به­صورت داخل هیپوکامپی و هر روز نیم ساعت قبل از انجام آزمون رفتاری ماز آبی تزریق انجام می­شد. به­دلیل اینک اثر اسکوپولامین روی تخریب حافظه موقتی است و بعد چند ساعت از بین می­رود بنابراین در هر روز آموزش نیم ساعت قبل تزریق انجام می­گیرد (23).

3- گروه دریافت­کننده تجمعات آمیلوئیدی لیزوزیم تهیه شده در غیاب کورکومین و یا آنالوگ آن که در روش کار شماره 2-2 توضیح داده  شد. (به این گروه به اختصار گروه آمیلوئید می­گوییم).

4- گروه دریافت­کننده تجمعات آمیلوئیدی تشکیل شده در حضور عصاره کورکومین که در روش کار شماره 3-2 توضیح داده شد.

5- گروه دریافت­کننده تجمعات آمیلوئیدی تشکیل شده در حضور آنالوگ کورکومینکه در روش کار شماره 3-2 توضیح داده شد. (به اختصار گروه آنالوگ کورکومین می­گوییم)

   گروه­های سوم، چهارم و پنجم، بیست روز پس از انجام تزریقات مورد ارزیابی مطالعه رفتاری قرار گرفتند (24).

4-2- بررسی سمیت فیبرهای آمیلوئیدی و تاثیر آن بر حافظه فضایی موش صحرایی توسط آزمون رفتاری ماز آبی موریس

به منظور بررسی میزان حافظه فضایی حیوانات، مازآبی موریس مورداستفاده قرار می‌گیرد. این وسیله از جمله وسایل و روش‌های مورد استفاده برای بررسی یادگیری و حافظه فضایی در جوندگان است. ماز آبی یک مخزن آب استوانه ای سیاه رنگ به قطر 152 سانتیمتر و ارتفاع 60 سانتیمتر تشکیل شده است که تا ارتفاع 5/32 سانتیمتری از آب پر می‌شود. دمای آب هم دمای اتاق آزمایشگاه و برابر با 2±21 درجه سانتیگراد است. یک سکوی قابل تغییر به ارتفاع 30 و قطر 10 سانتیمتر و به رنگ سیاه در مرکز یکی از ربع‌های مخزن قرار گرفته است که 2 سانتیمتر زیر آب قرار دارد. در طول آزمایش حرکات حیوان توسط دوربین ویدئویی که درست در بالای ماز قراردارد، از طریق نرم­افزار ردیاب ثبت می‌شود. این نرم­افزار قادر به اندازه گیری مسافت طی شده توسط حیوان و نیز مدت زمانی که حیوان در هر قسمت از ماز و ربع هدف به سرمی‌برد است. کل آزمایش شامل چهار روز آموزش (مرحله یادگیری یا آموزش) و یک روز آزمون (مرحله بازخوانی یا پروب) بود. در مرحله ی اول هر چهار روز آموزش شامل چهار بار رها کردن حیوان در ماز آبی است برای انجام این کار ماز به چهار قسمت مساویتقسیم می‌شود و موش 4 بار و هربار از یکی از سمت‌های چهارگانه‌ی شمال، جنوب، مغربومشرق که توسط برنامه ردیاباعلام می‌شود در مخزن رها می‌شود. در طی این آزمایش 60 ثانیه در نظر گرفته می‌شود تا حیوان بتواند به­طور اتفاقی سکوی مخفی را بیابد و روی آن قرار گیرد بعد از یافتن به موش به مدت 20 ثانیه زمان داده می‌شود تا با دیدن علائم موجود در اطراف موقعیت خود را شناسایی کند، این عمل به حیوان کمک می‌کند تا در جلسات بعدی با استفاده از علائم جایگاه را پیدا نماید. بعد از 20 ثانیه موش دوباره از جهت دیگر در استخر رها می‌شود. اما اگر در مدت 60 ثانیه حیوان قادر به پیدا کردن سکو نباشد به آرامی به طرف سکو راهنمایی می‌شود. پس از پیدا کردن سکو به او اجازه داده می‌شود تا 20 ثانیه بر روی سکو قرار گیرد و بعد از 20 ثانیه دوباره از جهت دیگر در استخر رها می‌شود. بعد از 4 بار موش از استخر خارج شده و به آرامی توسط حوله خشک شده و به قفس برگردانده می‌شود. در روز پنجم آزمون پروب انجام می­شود؛ بدین ترتیب که سکو را از داخل استخر خارج کرده و هر کدام از حیوانات یک بار از نقطه مشخصی که توسط نرم­افزار ردیاب اعلام می­گردد، به داخل استخر گذاشته می­شود. در مدت 60 ثانیه حضور حیوان در استخر، کل مسافت طی شده، تعداد دفعات ورود به ربع هدف و مدت زمانی که حیوان در ربع هدف از استخر (که سکو در آن قرار داشت) شنا می­کرد، اندازه­گیری می­شود (24).

5-2- آزمون و روش آماری

داده‌ها با استفاده از نرم­افزار آماری SPSSو با آزمون آماری ANOVA ـ MANOVA وبه تناسب نوع آزمایشات از آنالیز واریانس یک طرفه (آزمون به خاطرآوری حافظه فضایی) وبا آنالیز واریانس دوطرفه (روزهای آموزش) و در صورت معنی‌داری بودن آزمون، جهت تایید سطح معنی‌داری از آزمون تکمیلی LSD استفاده شد. نتایج به صورت میانگین ± خطای استاندارد و با (05/0 p<) به­عنوان شاخص معنی‌داری در نظر گرفته شد.

یافته­ها

1-3- القای تجمع آمیلوئیدی در لیزوزیم سفیده تخم مرغ

مطالعات قبلی پژوهشگران این مقاله نشان داد که سه آنالوگ ساخته شده برای کورکومین (جدول شماره 1) ضمن اینکه پایداری لازم در pH طبیعی بدن (4/7) را دارند مشابه کورکومین دارای خاصیت ضد آمیلوئیدی نیز هستند (21). از طرف دیگر ساختار آنالوگ شماره 3 فاقد گروه­های هیدروکسی می­باشد لذا در اثر مصرف خوراکی توسط آنزیم های کبدی و کلیوی بی­اثر نمی­گردد. در پژوهش حاضر اثر آمیلوئیدهای تشکیل شده در حضور کورکومین و آنالوگ شماره 3 (پایدار و بدون گروه هیدروکسی) روی حافظه فضایی موش صحرایی مورد بررسی قرار گرفت.

در این مطالعه بر اساس دستورالعمل ارائه شده در بخش روش­ها HEWL تبدیل به فیبر آمیلوئیدی گردید و وجود این ساختارها بعد از 48 ساعت با استفاده از مارکرهایی مثل تیوفلاوین T، قرمز کنگو و عکس میکروسکوپ نیروی اتمی تأیید شد (داده­ها ارائه نشده است) و نشان داده شد که فیبرهای تشکیل شده در حضور کورکومین و آنالوگ آن به­طور معنی­داری (5/0p<) سمیت سلولی کمتری نسبت به آمیلوئیدهای تشکیل شده در عدم حضور آنها دارند (19). هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر تجمعات تشکیل شده در حضور کورکومین و آنالوگ شماره 3 بر روی حافظه فضایی موش صحرایی است. جهت سنجش اثر تجمعات تشکیل شده در حضور و یا غیاب ترکیبات مورد مطالعه روی یادگیری، از ماز آبی موریس بر اساس توضیحات ارائه شده در بخش روش­ها استفاده گردید.

2-3- نتایج روزهای آموزش

زمان شنا کردن: جهت سنجش یادگیری، در طول مراحل آزمایش، فاکتور زمان سپری شده برای یافتن سکوی پنهان در 4 روز تست رفتار ماز آبی موریس مورد سنجش قرار گرفت. آنالیز واریانس دو طرفه داده­های زمان رسیدن به سکو (روز × گروه) نشان­دهنده وجود تفاوت معنی­دار بین

جدول 1 : نام و ساختار شیمیایی کورکومین و آنالوگ­های ساختاری آن طول رابط ساختار شیمیایی نام شیمیایی ترکیب 92/11   curcumin   84/8   2,6Bis(3,4-methylenedioxy benzylidene) 1- cyclohexanone آنالوگ 1 84/8   2, 6-divanillylidene cyclohexanone آنالوگ 2 84/8   2,6 Bis (3,4-dimethoxybenzylidene)- 1- cyclohexanone آنالوگ 3     نمودار 1: مدت زمان طی شده در ماز آبی موریس جهت یافتن سکوی پنهان توسط موش­های گروه­های مختلف در دوره آموزش. داده­ها به­صورت میانگین ± انحراف معیار نمایش داده شده است. با توجه به نتایج آزمون آماری روند یادگیری بین گروه­ها اختلاف معنی داری داشت.*** نشان­دهنده  ,001/0P<، **  نشان­دهنده 01/0P< و * نشان­دهنده 05/0p< نسبت به کنترل و ### نشان­دهنده 001/0P<، ##  نشان­دهنده 01/0P< در مقایسه با گروه­های  آسیب. مقادیر بر حسب میانگین± خطای استاندارد نمایش داده شده­ اند.

گروه­های آزمایشی ]p= 0.0000_،) =15/46_100، [F₍₄ و روزهای مختلف آموزش [F_{(3, 100 )} =11/54, P= 0.0001] می­باشد ولی بین روزهای آموزشی و گروه های مختلف تعامل معنی­داری وجود نداشت  [F_{(12, 100 )} =0/26369 , P =0. 9933].

در مقایسه درون گروهی بر اساس آزمون تکمیلیLSD ، گروه­های اسکوپولامین با (032/0p=) و لیزوزیم با (009/0p=) در روز چهارم نسبت به روز اول کاهش معنی­داری دارند. همچنین گروه کورکومین با ( 032/0p=)و گروه آنالوگ کورکومین با (019/0P=) در روز چهارم نسبت به روز اول کاهش معنی­دار داشتند. در مقایسه بین گروهی مشخص شد ضمن این­که گروه­های اسکوپولامین و لیزوزیم در هر چهار روز آموزشی نسبت به یکدیگر تفاوت معنی­دار نداشتند، گروه اسکوپولامین در روزهای اول، دوم، سوم با (05/0p<) و روز چهارم با (003/0p=) و گروه لیزوزیم در روزهای اول، دوم، چهارم با (000/0p=) و روز سوم با (008/0p=) نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­دار نشان داد. گروه­ کورکومین در هر چهار روز آموزشی با (05/0p<) و آنالوگ آن در روزهای اول و چهارم با (05/0p<) و روز دوم با (01/0p<)، نسبت به گروه­­­ لیزوزیم کاهش معنی­دار نشان دادند. همچنین گروه­ کورکومین وآنالوگ آن با (05/0p<) نسبت به گروه­­­ اسکوپولامین در هر چهار روز آموزشی کاهش معنی­دار نشان دادند.در ضمن اختلاف بین این دو گروه (کورکومین و آنالوگ آن) نیز با یکدیگر معنی­دار نبود.

مسافت طی شده برای یافتن سکو

 

نمودار 2: مسافت طی شده در ماز آبی موریس برای یافتن سکوی مخفی توسط موش­های گروه­های مختلف در روزهای آموزش. داده­ها به­صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده است. با توجه به نتایج آزمون آماری روند یادگیری بین گروه­ها اختلاف معنی داری داشت. *** نشان­دهنده 001/0P< ، **  نشان­دهنده 01/0P< نسبت به کنترل و ### نشان­دهنده  001/0P< در مقایسه با گروه­های آسیب. مقادیر بر حسب میانگین± خطای استاندارد نمایش داده شده­اند.     نمودار 3: مقایسه درصد مسافت طی شده در ربع هدف ماز آبی در آزمون به خاطرآوری. داده­ها به­صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده است. با توجه به نتایج آزمون آماری روند مسافت طی شده در ربع هدف بین گروه­های تیمار و گروه­های اسکوپولامین و لیزوزیم تفاوت معنی­داری را نشان می­دهد. * نشان­دهنده 05/0p< نسبت به کنترل و ##  نشان­دهنده 01/0P< در مقایسه باگروه­های آسیب. مقادیر برحسب میانگین±خطای استاندارد نمایش داده شده­اند.

مقدار مسافت طی شده جهت پیدا نمودن سکوی پنهان در گروه­های مختلف آموزشی در طی روزهای آموزش اندازه­گیری شد. آنالیز واریانس دو طرفه پارامتر مسافت طی شده  (بر اساس داده­های ارائه شده در نمودار شماره 2) برای  پیدا کردن سکوی نجات نشان دهنده وجود تفاوت معنی­دار بین چهار گروه مورد آزمایش ]p= 0.0000_،) =40/44_100، [F₍₄و روز‌های مختلف آموزش]p= 0.0000_،) =17/40_100، [F₍₃است. همچنین بین روزهای آموزشی و گروه‌های مختلف ]p= 0.0048_،) =2/59_100، [F₍₁₂تفاوت معنی­داری وجود دارد. در مقایسه درون گروهی بر اساس آزمون تکمیلیLSD  ،گروه­های اسکوپولامین با (0000/0p=) و لیزوزیم با (0000/0p=)در روز چهارم نسبت به روز اول کاهش معنی­داری دارند. در مقایسه بین گروهی مشخص شد ضمن این­که گروه­های اسکوپولامین و لیزوزیم در هر چهار روز آموزشی نسبت به یکدیگر تفاوت معنی­دار نداشتند، گروه اسکوپولامین در روزهای اول، دوم، سوم با (000/0p=) و روز چهارم با (003/0p=) و لیزوزیم در روزهای اول، دوم، چهارم با (000/0p=) و روز سوم با (006/0p=) نسبت به گروه کنترل افزایش معنی­دار نشان دادند. گروه­ کورکومین در روزهای اول و دوم با (000/0p=) و روز سوم با (05/0p<) و آنالوگ آندر روزهای اول و دوم با (000/0p=) و روز سوم با (05/0p<) نسبت بهگروه­­های­ لیزوزیم کاهش معنی­دار نشان دادند. همچنین گروه­ کورکومین در روزهای اول، دوم و سوم با (000/0p=) و گروه ­آنالوگ کورکومین در روزهای اول و دوم با (000/0p=) و روز سوم با (002/0p=) نسبت بهگروه­­های اسکوپولامین کاهش معنی­دار نشان دادند. در ضمن اختلاف بین این دو گروه (کورکومین و آنالوگ آن) نیز با یکدیگر معنی­دار نبود.

3-3-یافته‌های آزمون به خاطر آوری

برای ارزیابی و توانایی به خاطر آوری (روز پروب)، حیوانات در ماز قرار گرفتند و به آنها فرصت داده شد تا 60  ثانیه شنا کنند. مدت زمان سپری شده در ربع هدف، درصد مسافت طی شده در ربع هدف و تعداد دفعات ورود حیوان به ربع هدف در روز آزمون به خاطر آوری بررسی شد. میزان  ارزیابی این شاخصه ها در ربع هدف توسط حیوان در آزمون به خاطرآوری از شاخص­های مهمی می­باشند که حافظه فضایی و توانایی به خاطر آوری حیوان را می­سنجد.

درصد مسافت طی شده در ربع هدف

نتایج درصد مسافت طی شده در ربع هدف (در روز پروب) در نمودار شماره 3 آورده شده است. آنالیز واریانس یک طرفه حاکی از وجود تفاوت معنی­دار بین گروه­ها است[F_(4,25)=3.45 , P = 0.022]. آزمون تکمیلی LSD نشان داد که درصد مسافت طی شده در ربع هدف به­ترتیب در گروه­های لیزوزیم و اسکوپولامین نسبت به گروه­های کنترل (033/0P=) و (035/0P=) کاهش معنی­داری داشت. همچنین گروه­های تیمار با کورکومین و آنالوگ کورکومین  به­ترتیب با (036/0p= و (013/0 p=نسبت به گروهاسکوپولامین و با (035/0p= و (012/0p=) نسبت به گروه لیزوزیم افزایش معنی­داری داشتند. افزایش درصد مسافت طی شده در ربع هدف نشان­دهنده کارایی بالاتر حافظه فضایی می­باشد.

مدت زمان حضور در ربع هدف

در روز پروب، مدت زمان حضور هر یک از گروهها در ربع هدف مورد مطالعه قرار گرفت و نتایج آن در نمودار شماره 4 آورده شده است. آنالیز واریانس یک طرفه حاکی از وجود تفاوت معنی­دار بین گروه­ها می­باشد

[F_{(4,25 )=}27.4 P = 0.000]. آزمون تکمیلیLSD نشان داد که مدت زمان حضوردر ربع هدف در گروه­های لیزوزیم و اسکوپولامین نسبت به گروه­های کنترل  (000/0P=) کاهش معنی­داری داشت. گروه­های تیمار با کورکومینو آنالوگ کورکومین (0000/0p=) نسبت به گروه لیزوزیم و اسکوپولامین افزایش معنی­داری داشتند. افزایش مدت زمان حضور در ربع هدف نشان دهنده کارایی بالاتر حافظه فضایی می­باشد.

تعداد دفعات ورود حیوان به ربع هدف

یکی دیگر از پارامترهای مورد مطالعه تعداد دفعاتی است که هر یک از گروه­ها در روز پروب وارد ربع هدف می­شوند. نتایج حاصل از این مطالعه در نمودار شماره 5 آورده شده است. آنالیز واریانس یک­طرفه بیانگر وجود تفاوت معنی­دار از این نظر در بین گروه­ها می­باشد[F_(4,25)=10.08 , P= 0.0000] . آزمون تکمیلی LSD نشان داد که تعداد دفعات ورود حیوان به ربع هدف به­ترتیب در گروه­های لیزوزیم و اسکوپولامین نسبت به گروه­های کنترل (000/0P=) و (005/0P=) کاهش معنی­داری داشت. گروه­های تیمار با کورکومینو آنالوگ کورکومین با (000/0p=) نسبت به گروه لیزوزیم افزایش معنی­داری داشتند. همچنین گروه­های تیمار با کورکومین با  (000/0p=) و آنالوگ کورکومین با (01/0p=) نسبت به گروه اسکوپولامین افزایش معنی­داری داشتند.

 

 

نمودار شماره4 : مقایسه مدت زمان حضور در ربع هدف ماز آبی در آزمون به خاطرآوری. داده­ها به­صورت میانگین± انحراف معیار نمایش داده شده است. با توجه به نتایج آزمون آماری مدت زمان حضور در ر بع هدف بین گروه تیمار وگروه­ها یا سکو پولامینولیزوزی متفاوت معنی­داری را نشان می­دهد. *** نشان­دهنده  ,001/0P<، **  نشان­دهنده 01/0P< نسبت به گروه کنترل و ##  نشان­دهنده 01/0P< در مقایسه با گروه­های آسیب.  مقادیر بر حسب میانگین± خطای استاندارد نمایش داده شده­اند.     نمودار شماره 5: مقایسه تعداد دفعات ورود موش­ها به ربع هدف مازآبی در آزمون به خاطرآوری. داده­ها به­صورت میانگین±انحراف معیار نمایش داده شده است. با توجه به نتایج آزمون آماری تعداد دفعات ورود موش­ها به ربع هدف بین گروه­های تیمار وگروه­های اسکوپولامینولیزوزیم تفاوت معنی­داری را نشان می­دهد.*** نشان­دهنده  ,001/0P<، **  نشان­دهنده 01/0 P< نسبت به کنترل و ##  نشان­دهنده 01/0P< در مقایسه با گروه­های آسیب. مقادیربرحسب میانگین±خطای استاندارد نمایش داده شده­اند.

بحث

همان­طور که گفته شد، ما قبلا نشان دادیم که  هم کورکومین و هم آنالوگ 3 طراحی شده مانع تشکیل فیبرهای آمیلوئیدی می­گردند. از طرف دیگر تجمعات لیزوزیم تشکیل شده در حضور  هر دو ترکیب در مقایسه با تجمعات تشکیل شده در عدم حضور این ترکیبات بطور معنی داری سمیت سلولی کمتری داشتند. هدف مطالعه حاضر بررسی اثر تجمعات تشکیل شده در حضور و عدم حضور این دو ترکیب روی حافظه فضایی موش صحرایی بود. همانطور که مطالعات روی موشهای مدل آلزایمری  در ماز آبی نشان دادهر دو گروه تیمار از نظر زمان پیدا کردن سکوی نجات، مسافت طی شده برای پیدا  کردن سکو در روزهای آموزش و از نظر درصد مسافت طی شده در ربع هدف، مدت زمان حضور در ربع هدف و تعداد دفعات ورود به ربع هدف در روز آزمون به­طور معنی­داری عملکرد بهتری داشتند. امروزه مطالعات گسترده ای در زمینه اثر کورکومین روی حافظه فضایی صورت گرفته است.

Yang و همکاران نشان داده اند که کورکومین از طریق ممانعت از تشکیل الیگومرهای آمیلوئید بتا و همچنین با اتصال به پلاکها و فیبریلهای آمیلوئیدی و تخریب آنها می تواند باعث بهبود حافظه فضایی شود (25). Garcia-Alloza و همکاران (26) نیز در مطالعات خودشان نشان دادند که کورکومین دارای خاصیت ضد آلزایمری است و از طریق مهار تشکیل بتا-آمیلوئید، از بین بردن پلاک­های تشکیل شده و بهبود نسبی نورون­های آسیب دیده این نقش خود را ایفا می­کند. همان­طور که در بخش مقدمه به آن اشاره شد کورکومین علاوه بر اثر ضد آلزایمری، دارای اثرات دیگری از جمله خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد ویروسی، ضد التهابی و ضد سرطانی است (19). علی رغم این خواص متنوع  متأسفانه در محیط خون دارای پایداری ضعیفی است. تحقیقات گسترده­ای برای پایدار سازی آن از طریق کمپلکس کردن آن با الیگو ساکاریدهای حلقوی، سیکلودکسترین، نانو ذرات (28,27) و یا تولید آنالوگهای پایدار آن تاکنون صورت گرفته است. Chakraborti و همکاران (19) از طریق جایگزین کردن بخش دی کتون (diketone) کورکومین با حلقه­های ایزوکسالون (isoxazole) موفق به تولید آنالوگ نسبتاً پایدار آن شدند. ما نیز با طراحی آنالوگ شماره 3 علاوه بر جایگزین کردن گروه دی کتون، گروه­های هیدروکسی آنرا نیز مسدود نموده ونشان دادیم که نه تنها نسبت به کورکومین پایدار است بلکه فعالیت ضد تجمعی قابل مقایسه با کورکومین دارد (21). در این پژوهش برای بررسی اثر ضد تجمعی از پروتئین مدل لیزوزیم استفاده نمودیم.  این نتایج فرصتی را فراهم می­آورد که برای مطالعه بیماری آلزایمر از پروتئین­های مدل استفاده شود که ضمن اینکه دقیقا مشابه پروتئین βA قادر به تخریب حافظه فضایی و آلزایمر هستند و همچنین دارای مزایایی دیگری مثل پایداری زیاد، تکرار پذیری بالا و همچنین به دلیل ارزانی این پروتئینها نسبت به βA از لحاظ اقتصادی صرفه جویی در هزینه ها را به همراه دارد (22). مطالعات محققین دیگر نیز با القای تجمع آمیلوئیدی در پروتئین­های غیروابسته به بیماری (پروتئین­های مدل) مثل انسولین و یا یک پروتئین سنتتیک به­نام HypF-N و تزریق آن به موش صحرایی توانسته­اند باعث بیماری آلزایمر در موش­های صحرایی شوند (29,22). در مجموع مطالعات ما نشان داد که آنالوگ طراحی شده که علاوه بر اینکه نسبت به کورکومین در pH طبیعی بدن (4/7) پایدارتر است و همچنین خواص ضد تجمعی مشابه کورکومین دارد و همچنین تجمعات تشکیل شده در حضور آن مثل کورکومین غیر سمی بوده و حافظه فضایی موش صحرایی را تخریب نمی کند می تواند یک ترکیب مفید برای طراحی داروی ضد آلزایمر البته بعداز بررسی های بیشتر مورد استفاده قرار گیرد.

 

References

1. Acosta D, Wortmann M. Alzheimer’s Disease International World Alzheimer Report 2009. Prince, M. 2009:1–92.
2. Selkoe DJ. The molecular pathology of Alzheimer's disease. Neuron. 1991; 6(4):487–98.
3. Hardy J, Allsop D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends Pharmacol Sci. 1991; 12(10):383–8.
4. Sofiabadi M, Esmaeili MH, Haghdost Yazdy H, Azhdari Zarmehri H. The prenatal consumption of aqueous extract of Glycyrrhiza glabra, improves memory retrieval in mice. 2011;10(38):49-54.
5. Sofiabadi M, Rajaei F, Azhdari-Zarmehri H, Atashgar E, Ghadimi F. The effects of separate and combined stress during pregnancy on motor learning of offspring of rats. 2014;21(6):532-9.
6. Aggarwal BB, Sundaram C, Malani, N, and Ichikawa, H. Curcumin: The Indian solid gold. Adv. Exp. Med. Biol. 2007: 595, 1−75.
7. AggarwalBB, and Sung B. Pharmacological basis for the role of curcumin in chronic diseases: An age-old spice with modern targets. Trends Pharmacol. Sci. 2009: 30, 85−94
8. Qin XY, Cheng Y, Yu LC. Potential protection of curcumin against intracellular amyloid beta-induced toxicity in cultured rat prefrontal cortical neurons. Neuroscience letters. 2010; 480(1):21–4.
9. Ye J, Zhang Y. Curcumin protects against intracellular amyloid toxicity in rat primary neurons. International journal of clinical and experimental medicine. 2012; 5(1):44–9.
10. Begum AN, Jones MR, Lim GP, Morihara T, Kim P, Heath DD, et al. Curcumin structure-function, bioavailability, and efficacy in models of neuroinflammation and Alzheimer's disease. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2008; 326(1):196–2
11. Sun CY, Qi SS, Zhou P, Cui HR, Chen SX, Dai KY, et al. Neurobiological and pharmacological validity of curcumin in ameliorating memory performance of senescence-accelerated mice. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 2013; 105:76–82
12. Hoppe JB, Haag M, Whalley BJ, Salbego CG, Cimarosti H. Curcumin protects organotypic hippocampal slice cultures from Abeta1-42-induced synaptic toxicity. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 2013; 27(8):2325–30.
13. Tsai YM, Chien CF, Lin LC, Tsai TH: Curcumin and its nanoformulation:the kinetics of tissue distribution and blood–brain barrier penetration. Int J Pharm 2011;416:331–338.
14. Conboy L, Foley AG, O’Boyle NM, Lawlor M, Gallagher HC, Murphy KJ, Regan CM: Curcumin-induced degradation of PKCd is associated with enhanced dentate NCAM PSA expression and spatial learning in adult and aged Wistar rats. BiochemPharmacol. 2009;77:1254–1265.
15. Rinwa P, Kumar A: Piperine potentiates the protective effects of curcumin against chronic unpredictable stress-induced cognitive impairment and oxidative damage in mice. Brain Res. 2012;1488: 38–50.
16. Hatcher H, Planalp R, Cho J, Torti, F M, and Torti S V. Curcumin: From ancient medicine to current clinical trials. Cell. Mol. Life Sci. 2008;65: 1631−1652.
17. Leung, M H, and Kee TW. Effective stabilization of curcumin by association to plasma proteins: Human serum albumin and fibrinogen. Langmuir 2009;25: 5773−5777.
18. Wang Y J, Pan M-H, Cheng A-L, Lin L-I, Ho Y-S, Hsieh C-Y, and Lin J-K J. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products.J. Pharm. Biomed. Anal.1997; 15:1867-76.
19. Chakraborti G, Dhar V, Dwivedi A, Das A, Poddar G, Chakraborti G, Basu P, Chakrabarti A, Surolia B,Bhattacharyy A. Biochemistry  2013;52: 7449–7460.
20. Reinke AA, Gestwicki JE.Structure-activity relationships of amyloid beta-aggregation inhibitors based on curcumin: influence of linker length and flexibility. Chem. Biol. Drug. Des. 2007;70: 206–215
21. Ramshini H, mohammad-zadeh M, Ebrahim-Habibi A. Inhibition of amyloid fibril formation and cytotoxicity by a chemical analog of Curcumin as a stable inhibitor. Int. J. Biol. Macromol. 2015;78: 396-404.
22. Tatini F, Pugliese AM, Traini C, Niccoli S, Maraula G, Ed Dami T, Mannini B, Scartabelli T, Pedata F, Casamenti F, Chiti F.Amyloid-β oligomer synaptotoxicity is mimicked by oligomers of the model protein HypF-N.Neurobiol. Aging 2013; 34: 2100–2109.
23. Ebert U, Kirch W. Scopolamine model of dementia: electroencephalogram findings andcognitive performance. Eur J Clin Invest. 1998; 28: 944-9.
24. Wilcock DM, Gordon MN, Morgan D. Quantification of cerebral amyloid angiopathy and parenchymal amyloid plaques with Congo red histochemical stain. Nat Protocols 2006; 1: 1591-95.
25. Yang F, Lim GP, Begum AN, Ubeda OJ, Simmons MR, Ambegaokar SS, Chen PP, Kayed R, Glabe CG, Frautschy SA, Cole GM.Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5892-901.
26. Garcia-Alloza M, Borrelli LA, Rozkalne A, Hyman BT, Bacskai BJ: Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. J Neurochem 2007;102:1095–1104.
27. Tønnesen HH, Másson M, and Loftsson T. Studies of curcumin and curcuminoids. XXVII. Cyclodextrincomplexation: Solubility, chemical and photochemical stability. Int. J. Pharm. 2002; 244, 127−135.
28. Bisht S, Feldmann G, Soni S, Ravi R, Karikar C, and Maitra A. Polymeric nanoparticle-encapsulated curcumin “nanocurcumin”: A novel strategy for human cancer therapy. J. Nanobiotechnol.2007; 5: 3.
29. Kheirbakhsh R, Chinisaz M, Khodayari S, Amanpour S, Dehpour AR, Muhammadnejad A, Larijani B, Ebrahim-Habibi A. Injection of insulin amyloid fibrils in the hippocampus of male Wistar rats: report on memory impairment and formation of amyloid plaques. Neurol Sci. 2015 Mar 19(in press).

 

Study of Effect of a New Curcumin Derivative on Formation of Toxic aAggregates and Prevention of Learning and Spatial Memory Impairment in Male Wistar Rats

 

Hasan Ramshini

Department of  Biology, Payam Noor University, PO Box 19395-3697, Tehran, Iran.

 

Abdollah Mehrabadi

Department of  Biology, Payam Noor University, PO Box 19395-3697, Tehran, Iran.

 

Alireza Moslem

Assistant Professor of Anesthesiology, Iranian Research Center on Healthy Aging , sabzevar University of Medical Sciences, Sabzevar, Iran