نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم، تهران، ایران

2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران

3 دانشیار گروه میکروبیولوژی ، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران

چکیده

زمینه و هدف: امروزه یکی از دغدغه­های زیست محیطی، ورود پساب­های آلوده به ویژه صنایع شوینده و پاک­کننده‌ی حاوی دترجنت‌ها وسورفکتانت‌ها ازجمله پلی­سوربات­ها­ به آب­های سطحی و زیر زمینی می باشد. با توجّه به تماس انسان و سایر موجودات زنده با این مواد، زدایش و تجزیه آن‌ها اهمیّت فراوانی دارد. درپژوهش حاضر، تجزیه‌ی یک دترجنت غیریونی گروه پلی‌سوربات به نام تویین 80 توسّط باکتری‌های لیپولیتیک جدا شده از پساب و لجن فعّال پالایشگاه نفت تهران و تأثیردوعامل pH ودما بر روند تجزیه‌ی این دترجنت مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها: در جداسازی اوّلیّه‌ی آن‌ها از محیط کشت تریپتون سوی آگار(TSA) حاوی تویین80 وروغن زیتون با غلظت های متفاوت به‌طورجداگانه استفاده شد. سپس دومحیط کشت اختصاصی تریبوتیرین آگار و تویین آگاربه ترتیب جهت بررسی تولید آنزیم لیپازوتجزیّه‌ی تویین 80 مورداستفاده قرارگرفت. همچنین جهت تأیید تجزیه ترکیب مورد نظر از دو روش دستگاهی  اسپکتروفتومتری وطیف سنجی مادون قرمز (FTIR) استفاده گردید.
یافته­ها: نتایج حاصل نشان می‌دهد، باکتری‌های جدا شده با تولید آنزیم لیپاز قادر به تجزیه‌ی پلی‌سوربات 80 بوده وبهترین تجزیه کنندگان به ترتیبب باسیلوس سویه 1sp، سودوموناس آئروجینوزا و باسیلوس سویه 2 spمی باشند.سویه 1sp پس از شناسایی مولکولی براساس تعیین توالی ژن SrRNA16، به عنوان  Bacillus cereus ATCC14579 (T)شناخته شد.
نتایج بررسی تأثیردوعامل pH ودما برتسریع روند تجزیه تویین 80، سویه سودوموناس را گزینه مناسب تجزیه درpH اسیدی ودوباسیل گرم مثبت را گزینه مناسب تجزیه در pH قلیایی معرفی می نماید. سه باکتری مذکور در دمای ْ37 بهترین تجزیه رانشان دادند.
نتیجه­گیری: درپژوهش حاضر باکتری‌های لیپولیتیک جداشده از منابع محیطی، قادر به تجزیّه‌ی‌ دترجنت غیریونی تویین 80 از گروه پلی‌سوربات بودند. از بین باکتری‌های جدا شده، بهترین تجزیّه‌ی توسّط باسیلوس سرئوس مشاهده شد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Isolation of Lipolytic Bacteria from Environmental Resources for Biodegradation Polysorbates in Industrial Wastewater

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Adami ghamsari 1
  • Farzaneh Hosseini 2
  • Anita Khanaferi 3

چکیده [English]

Background & Objectives: Today, entrance of wastewaters, especially detergent and cleaner agent’s production industries wastewaters, to surface and underground waters is one of environmental pollution concerns. These  wastewaters are containing detergents and surfactants, such as polysorbates and, because of exposure of human and other organisms, their degradation is of great important. This research analyses degradation of a non-ionic detergent in polysorbate group called Tween 80 (polysorbate 80) and studies effect of pH and temperature on degradation rate of this detergent, using lipolytic bacteria (isolated from Tehran oil refinery wastewater and activated sludge).
Materials & Methods: For primary isolating of lipolytic bacteria, the TSA medium containing Tween 80 and olive oil has been, separatively, used. Then specific culture Tween agar and Tributyrin agar have been used to study for lipase enzyme bacteria production. Also for confirmation degradation, instrumental methods, spectrophotometer and FTIR were used.
Results: The results shows that the isolated bacteria are able to depredate polysorbate 80 by lipase enzyme production. Bacillus cereus was known as the best degradator after the identification of the molecular basis of sequencing 16S rRNA. Bacillus cereus ATCC 14579 (T), Pseudomonas aeruginosa and other Bacillus sp was known.
Conclusion: The results showed that pH and temperature affects on the degradation of tween, and the Pseudomonas aeruginosa at acidic range of pH, two gram positive bacillus at alkali range of pH and three bacteria at 37 ˚C have the best degradation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lipolytic bacteria
  • Environmental resources
  • Non-ionic detergent
  • Polysorbate
  • Tween 80
  • Industrial wastewater
  • Activated sludge
  • Degradation

 

 

 


جداسازی باکتری‌های لیپولیتیک از منابع محیطی به منظور تجزیّه‌ی   پلی سوربات‌ها در پساب‌های صنعتی

 

فاطمه آدمی قمصری 1*، دکترفرزانه حسینی2 ، دکتر آنیتا خنافری3

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم، تهران، ایران

2استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران

3دانشیار گروه میکروبیولوژی ، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران

 

*نشانی نویسنده مسؤول: تهران، شمیران، پاسداران، میدان هروی، خیابان مکران جنوبی، بوستان دهم، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، فاطمه آدمی قمصری

E-mail: Mahla_fag@yahoo.com

 

وصول:9/9/93 ،اصلاح:13/10/93 ،پذیرش:14/11/93

چکیده

زمینه و هدف: امروزه یکی از دغدغه­های زیست محیطی، ورود پساب­های آلوده به ویژه صنایع شوینده و پاک­کننده‌ی حاوی دترجنت‌ها وسورفکتانت‌ها ازجمله پلی­سوربات­ها­ به آب­های سطحی و زیر زمینی می باشد. با توجّه به تماس انسان و سایر موجودات زنده با این مواد، زدایش و تجزیه آن‌ها اهمیّت فراوانی دارد. درپژوهش حاضر، تجزیه‌ی یک دترجنت غیریونی گروه پلی‌سوربات به نام تویین 80 توسّط باکتری‌های لیپولیتیک جدا شده از پساب و لجن فعّال پالایشگاه نفت تهران و تأثیردوعامل pH ودما بر روند تجزیه‌ی این دترجنت مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها: در جداسازی اوّلیّه‌ی آن‌ها از محیط کشت تریپتون سوی آگار(TSA) حاوی تویین80 وروغن زیتون با غلظت های متفاوت به‌طورجداگانه استفاده شد. سپس دومحیط کشت اختصاصی تریبوتیرین آگار و تویین آگاربه ترتیب جهت بررسی تولید آنزیم لیپازوتجزیّه‌ی تویین 80 مورداستفاده قرارگرفت. همچنین جهت تأیید تجزیه ترکیب مورد نظر از دو روش دستگاهی  اسپکتروفتومتری وطیف سنجی مادون قرمز (FTIR) استفاده گردید.

یافته­ها: نتایج حاصل نشان می‌دهد، باکتری‌های جدا شده با تولید آنزیم لیپاز قادر به تجزیه‌ی پلی‌سوربات 80 بوده وبهترین تجزیه کنندگان به ترتیبب باسیلوس سویه 1sp، سودوموناس آئروجینوزا و باسیلوس سویه 2 spمی باشند.سویه 1sp پس از شناسایی مولکولی براساس تعیین توالی ژن SrRNA16، به عنوان  Bacillus cereus ATCC14579 (T)شناخته شد.

نتایج بررسی تأثیردوعامل pH ودما برتسریع روند تجزیه تویین 80، سویه سودوموناس را گزینه مناسب تجزیه درpH اسیدی ودوباسیل گرم مثبت را گزینه مناسب تجزیه در pH قلیایی معرفی می نماید. سه باکتری مذکور در دمای ْ37 بهترین تجزیه رانشان دادند.

نتیجه­گیری: درپژوهش حاضر باکتری‌های لیپولیتیک جداشده از منابع محیطی، قادر به تجزیّه‌ی‌ دترجنت غیریونی تویین 80 از گروه پلی‌سوربات بودند. از بین باکتری‌های جدا شده، بهترین تجزیّه‌ی توسّط باسیلوس سرئوس مشاهده شد.

واژه های کلیدی: جداسازی، باکتری‌های لیپولیتیک (تجزیه کننده‌ی چربی)، منابع محیطی، دترجنت غیریونی، پلی‌سوربات، تویین 80 ،  پساب صنعتی، لجن فعال، تجزیه.

 

مقدمه

امروزه آلودگی محیط زیست از مسائل مهمی است که جوامع بشری با آن روبه رو می باشد. رشد روز افزون فعّالیّت‌های صنعتی از یک سو و عدم رعایت الزامات زیست محیطی از سوی دیگر سبب شده تا چند دهه‌ی اخیر مقادیر زیادی از آلاینده­ها وارد محیط شوند.

تجمّع آلاینده­ها در محیط تهدیدی جدّی برای سلامت انسان، محیط زیست، سایر موجودات زنده و اکوسیستم است. یک دسته ازترکیبات آلوده کننده، پلی‌سوربات‌ها هستند که وارد پساب صنایع مرتبط از جمله صنایع شوینده شده وبر اساس فعّالیّت‌های مختلف در محیط زیست تجمّع می‌یابند(3و1).   

روش­های مرسوم جهت حذف آلودگی و تجزیّه‌ی برخی ترکیبات از پساب عبارتند از: حذف شیمیایی مانند اکسیداسیون، استفاده از کاتالیست­ها، حذف فیزیکی، حذف و تجزیّه‌ی بیولوژیک روش­های مذکور معایب متعدّدی همچون بر جا گذاشتن اثرات جانبی، هزینه‌ی بالا، کاهش راندمان تجزیّه وغیره را در بر دارند که روش های نوین می‌توانند جایگزین آن‌ها شوند(10).  

ترکیبات پلی‌سوربات یا استرهای سوربیتان با نام تجاری اسپن(SPAN) و اتوکسیلات آن‌ها با نام تجاری تویین(TWEEN)، سورفکتانت های غیریونی از گروه پلی­سوربات می­باشند. ترکیبات فوق مایعات روغنی هستند که از اتوکسیلاسیون سوربیتان شده با اسیدهای چرب حاصل­می­گردند. این دسته از ترکیبات، آمفی پاتیک یا دو قطبی هستند. یعنی، دارای بخش آب‌دوست (هیدروفیل) وآب‌گریز (هیدروفوب) قدرتمندی می­باشند.

به همین دلیل تمایل فراوانی به تجمّع در بین سطوح دارند لذا، به عنوان امولسیفایر، کنترل­کننده کف، ترکننده(حل­کننده) در صنایع مختلف مانند صنایع شوینده، غذایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی وغیره استفاده می‌گردند. تویین ها (استرهای اسید چرب پلی اکسی اتیلن سوربیتان)  دارای انواع 20 ،40 ،60 و80 می باشند(9 و8 و7).

پاکسازی و تجزیّه‌ی زیستی ارگانیسم­های طبیعی مزیّت­های بیشتری نسبت به ارگانیسم­های غیر طبیعی دارد. این مزایا شامل سرعت متفاوت رشد، فعّالیّت متابولیک گسترده و غیره می­باشد. امروزه گونه­های متعدّدی از میکروارگانیسم­ها در طبیعت شناخته شدند و یا در حال جداسازی می­باشند که به پاکسازی محیط زیست کمک کنند (5). باکتری‌های لیپولیتیک با تولید آنزیم لیپاز باعث تجزیّه‌ی ترکیبات لیپیدی مانند پلی‌سوربات می شوند (19و12و11). بهترین تولید کنندگان آنزیم لیپاز متعلّق به خانواده باسیلوس­ها از باسیل‌های گرم مثبت واز باسیل‌های گرم منفی خانواده سودوموناس‌ها مانند سودوموناس آئروجینوزا و فلورسنس می باشند. سایر باکتری‌ها مانند استافیلوکوکوس اورئوس نیز آنزیم لیپاز تولید می‌کنند.

لیپازها کاتالیزورهای حیاتی هستند که لیپیدها وتری گلیسیریدهای زنجیره‌ی بلند را به وسیله‌ی آب تجزیه می کنند و بازده‌ی آن اسید های چرب، منوگلیسیریدها، دی گلیسیریدها وگلیسیرین است. لیپازهای میکروبی به دلیل ویژگی های خاصی که دارند مورد توجّه بیشتری قرار می گیرند، که از آن‌ها در زمینه هاوصنایع مختلف غذا، دارو، دترجنت‌ها و غیره استفاده می‌گردد (19و18و16). 

پژوهش حاضر به بررسی تجزیّه‌ی دترجنت غیریونی پلی سوربات80 توسّط باکتری‌های لیپولیتیک جدا شده از پساب و لجن فعّال نفتی پالایشگاه نفت تهران وتأثیر دو عامل دما و  pHبر روند تجزیّه این دترجنت پرداخته است.

 

مواد و روش ها

جداسازی باکتری­ها ازمنابع محیطی

نمونه برداری: در این پژوهش، جداسازی باکتری های لیپولیتیک ازپساب (API) ولجن فعّال پالایشگاه نفت شهید تندگویان تهران به عنوان منابع محیطی انجام گرفته است. نمونه برداری از پساب و لجن فعّال با استفاده از ظروف مخصوص نمونه برداری شیشه ای 250 میلی لیتری استریل صورت گرفته است. دقت شد که حدود 3 سانتی متر از بالای بطری خالی بماند تا هنگام شروع آزمایش بتوان به راحتی و کامل نمونه را به هم زد و آن یکنواخت شود. روی هر نمونه تاریخ برداشت، دمای محل،  pH محلّ نمونه برداری و نوع نمونه نوشته شد. در مرحله بعدی به جهت بررسی باکتری‌های چربی‌دوست، ازمحیط تریپتون سوی آگاربا غلظت های 1درصد، 2درصد، 4درصد و 6درصد از تویین 80 و روغن زیتون به عنوان یک منبع چربی(لیپیدی) به صورت جداگانه دردو ظرف استفاده گردید. تویین 80 بادرصدخلوص 5/98 و5/5pH  خریداری شده ازشرکت مرک آلمان مورداستفاده قرار گرفت. جداسازی وخالص سازی پس ازچندین بار تجدید کشت انجام شد. پس ازاطمینان از خالص بودن باکتری‌ها، شناسایی براساس سه شاخص ماکروسکوپیک، میکروسکوپیک و آزمون­های بیوشیمیایی کتاب باکتریولوژیک سیستماتیک برگی (ازکشت تازه­ 24 ساعته باکتری­ها) انجام شد. شناسایی مولکولی بهترین تجزیه کننده تویین 80، بر اساس تعیین توالی ژن SrRNA16 انجام گرفت.

بررسی تجزیه‌ی پلی‌سوربات توسط باکتری‌های جدا شده

استفاده از محیط کشت تریبوتیرین آگار: محیط کشت تریبوتیرین آگار، محیط کشتی مخصوص بررسی باکتری‌های لیپولیتیک می باشد. این محیط حاوی اسید چرب تریبوتیرین است که باکتری‌های لیپولیتیک با تولید آنزیم لیپاز باعث تجزیّه‌ی این اسید چرب موجود در محیط شده وهاله شفاف اطراف کلنی باکتری ایجاد می نمایند. این تست نشان دهنده لیپولیتیک بودن باکتری های جداشده می باشد وتولید آنزیم لیپاز توسّط آن‌ها تأیید می­گردد. جهت انجام آزمایش، از هر نمونه باکتری در محیط مذکور به صورت  Tشکل و نقطه ای کشت داده شد وپس از گرماگذاری در دمای c˚37  به مدّت 48 تا 72 ساعت نتایج بررسی گردید.

استفاده از محیط کشت ترکیبی تویین آگار: از محیط کشت ترکیبی تویین آگار حاوی تویین 80، با  7 pH  که جهت بررسی تجزیّه‌ی تویین مناسب می باشد، استفاده گردید. این محیط حاوی اسید چرب 24 کربنه‌ی تویین 80 است. به علّت حضور کلرید کلسیم هیدراته(CaCl2,H2O) موجود در محیط، باکتری‌های کشت داده شده بر روی آن پس از رشد، با تولید آنزیم لیپاز وتجزیّه‌ی تویین 80، با کلرید کلسیم محیط ترکیب شده واولئات کلسیم تولید می کنند که به صورت رسوب سفید رنگی اطراف کلنی باکتری نمایان می شود. این امر نشان دهنده تجزیّه‌ی تویین موجود در محیط می باشد. این روش بر اساس پرسیپیتاسیون نمک کلسیم از اسید چرب آزاد شده از هیدرولیز تویین است. اسید چرب آزاد شده با کلسیم محیط باند شده واین ترکیب اولئات کلسیم به صورت کریستال نامحلول در اطراف کلنی باکتری مشاهده می شود. باکتری‌های جدا شده به صورت نقطه‌ای در محیط مذکورکشت داده شدند و به مدّت 48 تا 72 ساعت در دمای  c˚37 گرماگذاری ونتایج بررسی گردید.

بررسی تجزیّه‌ی تویین 80 باروش دستگاهی اسپکتروفتومتروFTIR

آماده سازی نمونه‌ها جهت بررسی تجزیّه با اسپکتروفتومتر و FTIR، در شرایط یکسان شامل محیط کشت نوترینت براث حاوی 1درصد تویین 80 و به میزان مساوی 1درصد از هر باکتری با غلظت 5/0 مک فارلند به‌طور جداگانه انجام شد. پس از 8 روزگرماگذاری c˚37،  جذب نوری حاصل از رشد باکتری ها در طول موج nm 600 و جذب نوری حاصل از تجزیّه‌ی تویین 80 در طول موج  nm 560 قرائت گردید.

جهت تـأییـد نهـایی، از روش دسـتگـاهی  FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) مدل NICOLET8700 استفاده گردید. روش مذکور به صورت کیفی، میزان تجزیه ترکیب مورد نظررا برروی نمودار به شکل طیف نمایش می­دهد.

بررسی تاثیر دو عاملpH ودمابرروند تجزیه

روش آماده سازی نمونه‌ها، همانند روش آماده سازی جهت بررسی دو روش دستگاهی می باشد. روند تجزیّه‌ی تویین 80 توسّط باکتری‌های جدا شده درpH های 5، 6، 7 و 8 و دماهای 30، 37، 40 و 45 درجه سانتی گراد بررسی گردیده است.

 

یافته­ها

یافته‌ها مربوط به جداسازی باکتری ها از منابع محیطی

حدود 40 نمونه باکتری جدا و خالص گردید. حدود 20 نمونه از مجموع نمونه ها به عنوان چربی‌دوست، ودرنهایت سه باکتری که توانایی رشد خوبی درمحیط های حاوی غلظت 6درصد ازتویین 80 و روغن زیتون را داشتند برای ادامه کار گزینش گردیدند.

یافته‌های مربوط به شناسایی باکتری‌ها

باکتری‌های جدا و خالص شده دارای کلنی هایی بااندازه، شکل و رنگ متفاوت بوده و پس ازرنگ آمیزی گرم از کشت 24 ساعته، به اشکال مختلف باسیل وکوکوباسیل گرم مثبت وگرم منفی، دارای اسپور وفاقد اسپور با جایگاه متفاوت مشاهده شدند.

ارزیابی فعّالیّت آنزیم لیپاز در محیط تریبوتیرین آگار

با کشت سه باکتری منتخب از بین باکتری‌های جدا شده در محیط اختصاصی تریبوتیرین آگار، دوباسیلوس 1 sp و 2sp و باسیل گرم منفی که با انجام آزمون های افتراقی سودوموناس آئرجینوزا شناسایی شد، قادر به تولید آنزیم لیپاز بوده واسید چرب موجود در محیط را هیدرولیز کرده و هاله شفاف با درجات مختلف اطراف کلنی باکتری ایجاد نمودند. واضح ترین و بهترین هاله ایجاد شده توسّط باسیلوس1 spمشاهده شد(شکل 2).

یافته‌های بررسی تجزیّه‌ی تویین 80 در محیط اختصاصی تویین آگار

سه باکتری‌ چربی‌دوست منتخب، نیز به جهت بررسی تجزیّه‌ی تویین 80، درمحیط تویین آگار حاوی تویین 80 که به صورت نقطه ای کشت داده شده بودند، با تجزیّه‌ی تویین 80 موجود در محیط به اسید چرب، درترکیب با کلسیم موجود در محیط، هاله رسوبی سفید رنگ اولئات کلسیم ایجاد نموده که در اطراف کلنی باکتری‌ ها قابل مشاهده است. از بین سه باکتری‌ مذکور، بهترین هاله رسوبی مشاهده شده متعلّق به باسیلوس 1 sp می باشد(شکل 3).

نتایج روش های دستگاهی:

بررسی میزان جذب نوری حاصل از رشد باکتری‎ها وتجزیّه‌ی تویین80 توسّط آن‌ها، نشان می‌دهد با افزایش زمان انکوباسیون، رشد باکتری­ها افزایش یافته وهم‌زمان با آن میزان تجزیه نیز افزایش پیدا کرده است.

میزان تجزیّه توسّط سه باکتری متفاوت امّا، نزدیک به هم مشاهده شد (نمودار1). مقایسه طیف‎های FTIR حاصل از تجزیّه‌ی تویین80 توسّط باکتری‌های مذکور با طیف‌های حاصل از نمونه شاهد (محیط کشت نوترینت براث حاوی 1درصد تویین 80) و تویین خالص، نشان می‌دهد باسیلوس1sp، سودوموناس آئروجینوزا و باسیلوس 2sp به ترتیب بهترین تجزیه رادارا می‌باشند (نمودار2).

یافته‎های تأثیّر pH : بررسی جذب نوری حاصل ازتجزیّه‌ی تویین80 توسّط سه باکتری منتخب مورد نظر درچهارpH  مختلف (5-8) نشان می‌دهد که باکتری سودوموناس آئروجینوزا بهترین تجزیه را در pHاسیدی (حدود 6) ودو باسیل گرم مثبت در pH قلیایی (حدود8) دارند.

نتایج تأثیر دما : بررسی جذب نوری حاصل از تجزیّه‌ی تویین توسّط سه باکتری مورد نظر در چهاردمای مختلف نشان می‌دهد هر سه باکتری بهترین تجزیه را در دمای ˚c37 دارند ودرسه دمای دیگر میزان تجزیه تقریبا ًبه یک میزان مشاهده گردید.

 

بحث

آلودگی های زیست محیطی یکی از مخاطرات دنیای امروزی می­باشد. ازجمله موارد قابل توجّه، آلودگی­های موجوددرپساب­ها ناشی ازتخلیّه‌ی پساب­های خانگی و صنعتی به ویژه صنایع شوینده و پاک کننده به محیط زیست می‌باشدکه با توجّه به تماس انسان و سایر موجودات زنده، زیان های جبران ناپذیری را به همراه خواهند داشت (17و2و1). ازآن‌جایی‌که پساب این صنایع به علّت داشتن غلظت بالای موادّ کف کننده مانند دترجنت­ها که نفوذ اکسیژن در پساب راکاهش می­دهند، از قدرت تصفیّه پذیری بیولوژیکی پایینی برخوردار می‌باشند و به‌طور مناسب به وسیله­ی سیستم های متداوّل بیولوژیکی تصفیّه نمی­شود (5). 

تویین ها سورفکتانت غیریونی از گروه پلی‌سوربات می­باشند که با نام تجاری اسپن (SPAN) معروفند ودارای انواع مختلفی می باشند. ترکیبات مذکورکه مایعات روغنی هستند واز اتوکسیلاسیون سوربیتان شده با اسید های چرب حاصل گردیدند، از مهم‌ترین و پرمصرف‌ترین انواع آن تویین 80 است که در این تحقیق تجزیه آن توسّط باکتری‌های لیپولیتیک جدا شده مورد بررسی قرار گرفته است (8 و7 و6).

باکتری­های لیپولیتیک با تولید آنزیم لیپاز باعث تجزیّه‌ی ترکیبات لیپیدی می­گردند. ازجمله­ی این باکتری‌ها باسیلوس­ها، سودوموناس، استافیلوکوک­هاو غیره می‌باشند که از لیپاز تولیدی آن‌ها در صنایع مختلف وتجزیه ترکیبات لیپیدی می‌توان استفاده نمود (18و15و13).در این پژوهش باسیل های گرم مثبت و گرم منفی که توانایی تجزیّه‌ی تویین 80 را دارند جداسازی و شناسایی شدند.

  جهت جداسازی باکتری هااز پساب (API) و لجن فعّال پالایشگاه نفت شهید تند گویان تهران از محیط کشت TSAحاوی روغن زیتون و تویین80 به‌طور جداگانه استفاده شد. ابتدا حدود40 باکتری جدا، سپس با استفاده از محیط کشت TSAحاوی غلظت 6درصد ازتویین 80 و روغن زیتون، 3 باکتری به عنوان چربی‌دوست ‌خوب جداسازی وپس از چندین بارتجدید کشت، خالص و انتخاب گردیدند. در پژوهش های مشابه نیز برای جداسازی باکتری‌های لیپولیتیک، ازمحیط حاوی روغن زیتون استفاده نمودند. پراساد روغن زیتون را بهترین منبع کربن برای تولید لیپاز از باسیلوس ها معرفی می‌نماید (11و10).

جهت جداسازی باکتری‌های تولید کننده‌ی لیپاز ازخاک وجهت بررسی تولید آنزیم لیپاز در باسیلوس سوبتیلیس و پومیلوس وهمچنین درچندپژوهش­ دیگرنیز به منظورارزیابی فعّالیّت آنزیم لیپازوجداسازی باکتری­های لیپولیتیک، ازمحیط کشت اختصاصی تریبوتیرین آگار استفاده نموده اند. در پژوهش حاضر نیز به‌جهت بررسی فعّالیّت آنزیم لیپاز و لیپولیتیک بودن باکتری‌های چربی دوست منتخب، باکتری‌ها درمحیط کشت تریبوتیرین آگارکشت داده شدند و پس ازگرماگذاری، هاله شفاف اطراف کلنی باکتری­ها بررسی گردید. همچنین جهت بررسی تجزیه تویین80، نیزاز محیط ترکیبی تویین آگار حاوی تویین 80 وپپتون استفاده شده است.

حسینی و همکارانش درپژوهشی که برروی تجزیّه‌ی دترجنت یونی (SDS) با استفاده از باکتری‌های جدا شده از لجن فعّال انجام دادند، از روش دستگاهی اسپکتروفتومترنیزاستفاده نمودند(19و4). در پژوهش حاضر، جهت سنجش میزان رشد و تجزیه تویین80 علاوه برروش دستگاهی اسپکتروفتومتر، ازطیف سنجی مادون قرمز(FTIR ) نیزاستفاده گردید. بررسی طیف‌های حاصل از میزان جذب نوری حاصل از رشد باکتری­ها در طول موجnm 600، جذب نوری حاصل از تجزیه تویین80 در طول موج nm560 ومقایسه آن با نمونه شاهد، نشان دهنده‌ی تجزیه ترکیب مذکور توسّط باکتری‌های جدا شده می باشد.

قمصری وهمکارانش سودوموناس آئروجینوزای سویه KM110 را از خاک جدا و تأثیر چهار دما ( 25، 35، 45 و 55 درجه سانتی گراید) و pH های 4 تا 12 را برتولید لیپاز توسّط باکتری مذکور بررسی نمودند. بیشترین تولید لیپاز را در دمای C˚37 و C˚45 ودر 12-8 pH مشاهده کردند (18). درپژوهش حاضرتأثیر چهاردمای30، 37، 40 و 45 درجه سانتی گراد وچهارpH 5، 6، 7 و8 بررسی گردید. نتایج حاصل ازتأثیر چهارpH­ وچهاردمای مختلف بر روند تجزیّه‌ی تویین 80 نشان داد که سودوموناس آئروجینوزا گزینه مناسب تجزیه در pH اسیدی ودوسویه باسیل گرم مثبت گزینه مناسب تجزیه در pH قلیایی می باشد. هر سه باکتری مذکور بهترین تجزیه را در دمای C˚37  نشان دادند.

پژوهش حاضر بهترین تجزیه کنندگان تویین 80 از بین باکتری های جدا شده از پساب و لجن فعال نفتی را به ترتیب : باسیلوس سرئوس با ATCC14579 (T)، سودوموناس آئروجینوزا وباسیلوس2 sp معرفی می‌نماید.

تشکر و تقدیر

از اساتید و پرسنل محترم آزمایشگاه میکروبیولوژی و شیمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال و مدیرعامل محترم پالایشگاه نفت شهید تندگویان تهران نهایت تقدیر و تشکر را دارم. مقاله حاضر حاصل پایان نامه کارشناسی ارشد می باشد.

 

 

 

 

References

  1. Ojo OA,OSO BA. Isolation and characterization of synthetic detergent degraders from Wastewater. Afr J Biotechnol. 2008; 7(20): 3753-60.
  2. Ertugrul S,Donmez G, Takac S. Isolation of lipase producing Bacillus sp. From olive mill wastewater and improving its enzyme activity.  J Hazard Mater. 2009; 149(3): 720-4.
  3. CipinyteV,Grigiskis S,Baskys E. Selection of fat-degradation microorganisms for The treatment of lipid-contaminated environment.Biology J. 2009; 35: 84-92.
  4. Hosseini F, Malekzadeh F, Amirmozafari N, Ghaemi N. Biodegradation of anionic surfactantsby isolated bacteria from activated sludge. Int J Environ Sci Tech. 2007;4 (1): 127-32.[Persian]
  5. Juan  L, Gabriela M, Esperanza R, Petia M, Luciano S, Lina C, et al. Isolation and Identification of Bacterial Strains from a Mixed Wastewater Treatment  System  Used to Treat PetrocheMical Effluents. 2009.
  6. Morelli J,SzajerG. Analysis of Surfactant. J Surfactants Deterg.2012;4(1): 75-83.
  7. JayashreeR, VasudevanN. Effect of Tween 80 added to the soil on the degradation if endosulfan by Pseudomonas aeroginosa. Int J Environ SciTech. 2010;4(2):203-10.
  8. Zhou J, Jiang W, Ding J, Zhang X, Gao S. Effect of tween 80 and B-Cyclodextrin on degradation of decabromodiphenyl ether (BDE-209) by white Rot fungi. Chemosphere. 2007; 70(2): 172-7.
  9. Negm NA,Saad El-Tabl A, Aiad IA, Zakareya K, Moustafa AH.Synthesis, Characterization, Biodegradation and Evaluation of the Surfce Active Propertis of Nonionic Surfactants Derived from Jatropha,Oil.J Surfactants Deterg. 2013; 16(6): 857-63.
  10. Prasad MP, Manjunath  k. Comparative  Study on biodegradation of lipid-rich wastewater using lipas producing bacterial specis. Indian J Biotechnol.2011;10:121-4.
  11. Tarntip R, Sirichom T. Isolation of Proteolytic, lipolytic and bioemulsifing bacteria for improvement of the aerobic treatment of poultry processing wastewater. Afr J Microbiol.2011; 5(30): 5493-7.
  12. Bhavani M, Chowdary GV, David M, Archana G. Screening , Isolation and Biochemical characterization of Novel Lipase Producing  Bacteria from Soil samples. International Journal of Biology Engineering. 2012; 2(2):18-22.
  13. Hoon Joo  M, Yeon Kim  J. characteristics of crude oil biodegradation by biosurfactant-producing bacterium Bacillus subtilis JK-1. J Korean soc Appl Biol chem. 2013; 56: 193-200.
  14. Liaw RB, Cheng MPWu MCLee CY.Use of metagenomic approaches to isolate lipolytic genes from activated sludge. Bioresour Technol. 2010; 101(21): 8323-9.
  15. Muir  DO, Phillips  DG, Dalgle SH. The lipolityc and proteolytic activity of bacteria isolated from blended raw milk. Int J Dairy Technol. 1979;32(1):19-23.
  16. Parkash M,Rajasekar K, KarmegamN. Bacterial Population of  Raw Milk and Their Proteolytic and LipolyticActivites.Res J Basic Appl Sci .2007;3: 848–51.
  17. Pirsaheb M, Almasi A, Zinatizade AA, khamutian R, Delangizan S. Economic Comparison of Standard Method with E-Jurdo Simplified Method to Measure Linear AlktlBenzenenesulfonates in Municipal Wastewaters.Iran J Health & Environ. 2011; 4(2): 245-53.
  18. Mobarak-Qamsari E, Kasra-Kermanshahi R, Moosavi-nejad Z. Isolation and identification of a novel, lipas-producing bacterium , pseudomonas aeruginosa KM110. IranJ Microbiol.2011;3(2): 92-8.
  19. Maier MS, de Faria DLA, Boschín MT,Parera SD. Characterization of reference lipids and theit degradation products by Raman spectroscopy, nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry.Issue in Honor of Prof. 2005;311-8.
  20. Mauerer A. Secondary Structural Changes of Spray Dried Protein With Fourier Transform Infrared Spectroscopy.2006.
  21. Shabtai  Y. Isolation and Characterization of a Lipolytic  Bacterium Capable of Growing in a Low-water-content Oil-water Emulsion.Appl Envairon Microbiol. 1991; 57(6): 1740-5.
  22. Watanabe  K. Molecular Detection , Isolation and Physiological Characterization of Functionally Dominant Phenol-degrading Bacteria in Activated Sludge.Appl Environ Microbiol. 1998; 64(11): 4396-402.
  23. Ehara K, Iiyoshi Y, Tsutsumi Y, Nishida T. Polyethyiene degradation by manganese peroxidase in the absence of hydrogen peroxide. J wood sci. 2000;46:180-3.
  24. Watanabe K, Teramoto MFutamata HHarayama S. Molecular Detection. Isolation and Physiological Characterization of Functionally Dominant Phenol-degrading Bacteria in Activated Sludge. Appl Environ Microbiol. 1998; 64(11): 4396-402.
  25. Walter  V, Syldatk C, Hausmann R. Screening Concepts for the Isolation of  Biosurfactant producing  Microorganisms.Adv Exp Med Biol. 2010; 672: 1-3.
  26. Ali  A, NaseemF. Frequency distribution of bacteria isolated from different industrial effluents. Daffodil Int Univ JSci Techn. 2012;7(1): 28-33.
  27. Walter V,Syldatk C, Hausmann R. Screening Concepts for the Isolation of  Biosurfactant producing  Microorganisms.Adv Exp Med Biol. 2010;672: 1-13.
  28. Sirisha E,Rajasekhar N,Narasu ML. Isolation and optimization of lipase producing bacteria from oil con-taminated soils.Adv Biol Res. 2010;4(5): 249-52.
  29. Mukherjee S, Das P, Sen R. Rapid quantification of microbialsurfactant bya simple turbidometric method.JMicrobiolMethods. 2009; 76(1): 38-42.

 

 

 

 

 

 

 


Isolation of Lipolytic Bacteria from Environmental Resources for Biodegradation Polysorbates in Industrial Wastewater

 

Fatemeh Adami Ghamsari ,

M.Sc., Department of  Microbiology, Basic  Science  Collage, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran.

 

Farzaneh Hosseini ,

Associate Prof., Department of  Microbiolog, Basic  Science  Collage, Islamic Azad University, North Tehran  Branches, Tehran, Iran.

 

Anita khanafari ,

Associate  Prof., Department of  Microbiolog, Basic  Science  Collage, Islamic Azad University, North Tehran and Science and Research Branches, Tehran, Iran.

 

Received:30/11/2014, Revised:03/01/2015, Accepted:03/02/2015


Abstract

Background & Objectives: Today, entrance of wastewaters, especially detergent and cleaner agent’s production industries wastewaters, to surface and underground waters is one of environmental pollution concerns. These  wastewaters are containing detergents and surfactants, such as polysorbates and, because of exposure of human and other organisms, their degradation is of great important. This research analyses degradation of a non-ionic detergent in polysorbate group called Tween 80 (polysorbate 80) and studies effect of pH and temperature on degradation rate of this detergent, using lipolytic bacteria (isolated from Tehran oil refinery wastewater and activated sludge).

Materials & Methods: For primary isolating of lipolytic bacteria, the TSA medium containing Tween 80 and olive oil has been, separatively, used. Then specific culture Tween agar and Tributyrin agar have been used to study for lipase enzyme bacteria production. Also for confirmation degradation, instrumental methods, spectrophotometer and FTIR were used.

Results: The results shows that the isolated bacteria are able to depredate polysorbate 80 by lipase enzyme production. Bacillus cereus was known as the best degradator after the identification of the molecular basis of sequencing 16S rRNA. Bacillus cereus ATCC 14579 (T), Pseudomonas aeruginosa and other Bacillus sp was known.

Conclusion: The results showed that pH and temperature affects on the degradation of tween, and the Pseudomonas aeruginosa at acidic range of pH, two gram positive bacillus at alkali range of pH and three bacteria at 37 ˚C have the best degradation.

Keywords: Lipolytic bacteria; Environmental resources; Non-ionic detergent; Polysorbate;  Tween 80; Industrial wastewater; Activated sludge; Degradation.

 

 

 

 

 

 

Correspond Author: 

Fatemeh Adami Ghamsari,

Tehran, Department of Microbiology, Basic Science Collage, Islamic Azad University, North Tehran Branch,

Email : Mahla_fag@yahoo.com

  1. Ojo OA,OSO BA. Isolation and characterization of synthetic detergent degraders from Wastewater. Afr J Biotechnol. 2008; 7(20): 3753-60.
  2. Ertugrul S,Donmez G, Takac S. Isolation of lipase producing Bacillus sp. From olive mill wastewater and improving its enzyme activity.  J Hazard Mater. 2009; 149(3): 720-4.
  3. CipinyteV,Grigiskis S,Baskys E. Selection of fat-degradation microorganisms for The treatment of lipid-contaminated environment.Biology J. 2009; 35: 84-92.
  4. Hosseini F, Malekzadeh F, Amirmozafari N, Ghaemi N. Biodegradation of anionic surfactantsby isolated bacteria from activated sludge. Int J Environ Sci Tech. 2007;4 (1): 127-32.[Persian]
  5. Juan  L, Gabriela M, Esperanza R, Petia M, Luciano S, Lina C, et al. Isolation and Identification of Bacterial Strains from a Mixed Wastewater Treatment  System  Used to Treat PetrocheMical Effluents. 2009.
  6. Morelli J,SzajerG. Analysis of Surfactant. J Surfactants Deterg.2012;4(1): 75-83.
  7. JayashreeR, VasudevanN. Effect of Tween 80 added to the soil on the degradation if endosulfan by Pseudomonas aeroginosa. Int J Environ SciTech. 2010;4(2):203-10.
  8. Zhou J, Jiang W, Ding J, Zhang X, Gao S. Effect of tween 80 and B-Cyclodextrin on degradation of decabromodiphenyl ether (BDE-209) by white Rot fungi. Chemosphere. 2007; 70(2): 172-7.
  9. Negm NA,Saad El-Tabl A, Aiad IA, Zakareya K, Moustafa AH.Synthesis, Characterization, Biodegradation and Evaluation of the Surfce Active Propertis of Nonionic Surfactants Derived from Jatropha,Oil.J Surfactants Deterg. 2013; 16(6): 857-63.
  10. Prasad MP, Manjunath  k. Comparative  Study on biodegradation of lipid-rich wastewater using lipas producing bacterial specis. Indian J Biotechnol.2011;10:121-4.
  11. Tarntip R, Sirichom T. Isolation of Proteolytic, lipolytic and bioemulsifing bacteria for improvement of the aerobic treatment of poultry processing wastewater. Afr J Microbiol.2011; 5(30): 5493-7.
  12. Bhavani M, Chowdary GV, David M, Archana G. Screening , Isolation and Biochemical characterization of Novel Lipase Producing  Bacteria from Soil samples. International Journal of Biology Engineering. 2012; 2(2):18-22.
  13. Hoon Joo  M, Yeon Kim  J. characteristics of crude oil biodegradation by biosurfactant-producing bacterium Bacillus subtilis JK-1. J Korean soc Appl Biol chem. 2013; 56: 193-200.
  14. Liaw RB, Cheng MPWu MCLee CY.Use of metagenomic approaches to isolate lipolytic genes from activated sludge. Bioresour Technol. 2010; 101(21): 8323-9.
  15. Muir  DO, Phillips  DG, Dalgle SH. The lipolityc and proteolytic activity of bacteria isolated from blended raw milk. Int J Dairy Technol. 1979;32(1):19-23.
  16. Parkash M,Rajasekar K, KarmegamN. Bacterial Population of  Raw Milk and Their Proteolytic and LipolyticActivites.Res J Basic Appl Sci .2007;3: 848–51.
  17. Pirsaheb M, Almasi A, Zinatizade AA, khamutian R, Delangizan S. Economic Comparison of Standard Method with E-Jurdo Simplified Method to Measure Linear AlktlBenzenenesulfonates in Municipal Wastewaters.Iran J Health & Environ. 2011; 4(2): 245-53.
  18. Mobarak-Qamsari E, Kasra-Kermanshahi R, Moosavi-nejad Z. Isolation and identification of a novel, lipas-producing bacterium , pseudomonas aeruginosa KM110. IranJ Microbiol.2011;3(2): 92-8.
  19. Maier MS, de Faria DLA, Boschín MT,Parera SD. Characterization of reference lipids and theit degradation products by Raman spectroscopy, nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry.Issue in Honor of Prof. 2005;311-8.
  20. Mauerer A. Secondary Structural Changes of Spray Dried Protein With Fourier Transform Infrared Spectroscopy.2006.
  21. Shabtai  Y. Isolation and Characterization of a Lipolytic  Bacterium Capable of Growing in a Low-water-content Oil-water Emulsion.Appl Envairon Microbiol. 1991; 57(6): 1740-5.
  22. Watanabe  K. Molecular Detection , Isolation and Physiological Characterization of Functionally Dominant Phenol-degrading Bacteria in Activated Sludge.Appl Environ Microbiol. 1998; 64(11): 4396-402.
  23. Ehara K, Iiyoshi Y, Tsutsumi Y, Nishida T. Polyethyiene degradation by manganese peroxidase in the absence of hydrogen peroxide. J wood sci. 2000;46:180-3.
  24. Watanabe K, Teramoto MFutamata HHarayama S. Molecular Detection. Isolation and Physiological Characterization of Functionally Dominant Phenol-degrading Bacteria in Activated Sludge. Appl Environ Microbiol. 1998; 64(11): 4396-402.
  25. Walter  V, Syldatk C, Hausmann R. Screening Concepts for the Isolation of  Biosurfactant producing  Microorganisms.Adv Exp Med Biol. 2010; 672: 1-3.
  26. Ali  A, NaseemF. Frequency distribution of bacteria isolated from different industrial effluents. Daffodil Int Univ JSci Techn. 2012;7(1): 28-33.
  27. Walter V,Syldatk C, Hausmann R. Screening Concepts for the Isolation of  Biosurfactant producing  Microorganisms.Adv Exp Med Biol. 2010;672: 1-13.
  28. Sirisha E,Rajasekhar N,Narasu ML. Isolation and optimization of lipase producing bacteria from oil con-taminated soils.Adv Biol Res. 2010;4(5): 249-52.
  29. Mukherjee S, Das P, Sen R. Rapid quantification of microbialsurfactant bya simple turbidometric method.JMicrobiolMethods. 2009; 76(1): 38-42.